基于NF-κB信号通路研究加味阳和汤对破骨细胞活性的影响

★ 杨佛 杨文龙 李明慧 刘璞 李威 杨智军 刘江源 罗云丰 杨凤云（.南昌市洪都中医院 南昌 0006；.江西中医药大学附属医院 南昌 0006；.江西中医药大学 南昌 0004）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量低、骨组织显微结构破坏、易发生骨折为特征的疾病。我国是世界上老年人口绝对数最大的国家，随着人口老龄化的日益加重，骨质疏松症已成为危害老年人健康的重大问题［1］。骨质疏松症具体病因不明，而成骨细胞（osteoblast，OB）功能下降及破骨细胞（osteoclast，OC）功能亢进是导致其发生的病理机制。当前越来越多研究表明破骨细胞功能亢进是导致骨质疏松症的重要因素［2］。

本课题组前期研究发现加味阳和汤（jiawei yanghe decoction，JWYHD）能增强成骨细胞活性［3］，但对破骨细胞作用不详，本研究从破骨细胞角度研究加味阳和汤对破骨细胞的影响，为加味阳和汤治疗骨质疏松症提供理论支持。

1 材料

1.1 实验动物 健康SPF级8周龄雄性SD大鼠65只，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002，饲养于江西中医药大学分子生物学重点实验室动物房内，分笼饲养，每笼4只，在相同条件下自由饮水、食用标准饲料。

1.2 实验仪器 大型旋转蒸发仪（瑞士步琪，型号R-220SE）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司，型号CKX41型）；多功能酶标仪（瑞士Tecan公司，型号SPARK 10M型）；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号IX71型）。

1.3 实验药物及试剂 加味阳和汤药物组成：熟地15 g，肉桂10 g，鹿角胶10 g，麻黄10 g,白芥子10 g,鸡血藤20 g，木瓜6 g，炮姜炭6 g，汉防己10 g，甘草3 g，购自江西中医药大学附属医院中药房；RAW264.7细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞库（批号A110203481）；Murine M-CSF、MurinesRANK-Ligand（美国Peprotech公司，批号分别为315-02-10、315-02-10）；CCK8检测试剂盒（北京Bioss公司，批号BA00208）；抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒（碧云天公司，批号P0332）；细胞核蛋白和浆蛋白抽提试剂盒（碧云天公司;批号P0028）；p65一抗（Proteintech公司，批号10745-1-AP-50 μL）；IκB-α一抗（Proteintech公司，批号10268-1-AP-50 μL）。

2 方法

2.1 加味阳和汤含药血清的制备 加味阳和汤煎药时按生药量的8倍量（除鹿角胶）加水浸泡30 min，武火煮沸后文火煮40 min，把药液倒出，再加等量水文火煮40 min，将两次药液混合，纱布过滤，将鹿角胶烊化后倒入药液，用大型旋转蒸发仪将药液蒸发浓缩至每毫升药液含2 g生药量,最后高温封瓶，放入4 ℃冰箱中保存备用。65只SD大鼠随机分为加味阳和汤组和生理盐水组，其中生理盐水组35只，加味阳和汤组30只。加味阳和汤组予2 g/（kg·d）剂量灌胃，生理盐水组予等量生理盐水灌胃，每天1次，连续灌胃8 d，末次灌胃2 h后行腹主动脉采血，离心取上清，并在56 ℃水浴锅中灭活，用0.22 μm的一次性滤菌器过滤后放入-80 ℃冰箱中冻存备用。

2.2 破骨细胞的诱导培养 RAW264.7细胞传代后按1×105/孔的密度种植在6孔板中，加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10% FBS诱导培养，每两天半量换液，直至镜下见有大量体积较大的破骨细胞时即为诱导成功。

2.3 CCK8法检测加味阳和汤血清对RAW264.7细胞活性的影响 RAW264.7细胞传代后按5×103个/孔的密度种植到96孔板中培养。96孔板分为5组，每组设6个复孔，每孔加入100 μL的10%FBS，放入培养箱中培养24 h。细胞贴壁后更换培养液，5组分别加入20%浓度的生理盐水血清、5%、10%、20%、40%浓度的加味阳和汤血清干预培养24 h，24 h后每孔加入10 μL的CCK8溶液，放入37 ℃恒温孵育箱中孵育2 h，2 h后在酶标仪上检测450 nm波长处的光密度值，比较含药血清组与生理盐水组光密度值是否有差异。

2.4 细胞培养上清TRAP值检测 RAW264.7细胞传代后按1×105个/孔的密度种植到6孔板中，放入培养箱中预培养24 h。24 h后更换培养液，其中6孔板分成生理盐水组、诱导组、加味阳和汤低、中、高剂量组5组，其中生理盐水组培养液不加诱导因子，其余4组培养液均加含M-CSF（50 ng/mL）和RANKL（100 ng/mL）的血清，放入培养箱中干预24 h后收集各孔细胞上清，用抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒检测，根据说明书酶活性定义计算出各组抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP值。

2.5 Western Blot法检测破骨细胞细胞核p65蛋白和细胞质IκB-α蛋白表达 RAW264.7细胞传代后按1×105个/孔的密度种植到6孔板中，分为生理盐水组、诱导组、加味阳和汤低、中、高剂量组5组，每孔加入2 mL的10% FBS，放入培养箱中预培养24 h。24 h后更换培养液，生理盐水组加入20%生理盐水血清，其余4组均加入含M-CSF（50 ng/ml）、RANKL（100 ng/ml）、加味阳和汤的血清，放入培养箱中干预培养24 h，24 h后取出6孔板，用细胞核蛋白和浆蛋白抽提试剂盒分别提取破骨细胞细胞质和细胞核蛋白。BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并定量，将蛋白变性后依据等体积上样原则上样，再依次经电泳、转膜、封闭、孵一抗、洗一抗、孵二抗、洗二抗步骤，最后在凝胶成像系统上进行曝光，并进行条带分析，计算目的蛋白/内参蛋白比值。

2.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠灌胃情况及含药血清制备情况 灌胃前后大鼠精神状态均良好，灌胃过程因误入大鼠气管导致死亡2只，均为加味阳和汤组。制备含药血清时因采血针刺穿血管导致采血失败6只，2只为加味阳和汤组，4只为生理盐水组。

3.2 加味阳和汤血清对细胞活性的影响 加味阳和汤血清浓度为5%、10%、20%时，与生理盐水组比光密度值差异均无统计学意义（P＞0.05）；当其浓度为40%时，其光密度值与生理盐水组比下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 加味阳和汤血清对RAW264.7细胞活性及干预破骨细胞后上清TRAP活力值的影响（±s）

表1 加味阳和汤血清对RAW264.7细胞活性及干预破骨细胞后上清TRAP活力值的影响（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05；与诱导组比较，**P＜0.01。

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3.3 各组细胞上清液TRAP活力值 与诱导组比，加味阳和汤血清组TRAP活力值降低，随着干预浓度的提高，TRAP值降低越明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

3.4 加味阳和汤血清对破骨细胞细胞核p65、细胞质IκB-α蛋白表达的影响 与生理盐水组比较，诱导组p65蛋白表达增加；与诱导组比，加味阳和汤血清干预组p65表达降低，且浓度越高，p65蛋白表达越低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与生理盐水组比，诱导组IκB-α蛋白表达降低；与诱导组比，加味阳和汤血清干预组IκB-α蛋白表达增加，且药物浓度越高，IκB-α蛋白表达越高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2和图1。

表2 味阳和汤血清对细胞核p65、细胞质IκB-α蛋白表达的影响（±s）

表2 味阳和汤血清对细胞核p65、细胞质IκB-α蛋白表达的影响（±s）

注：与诱导组比较，**P＜0.01。

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图1 破骨细胞细胞核p65、细胞质IκB-α蛋白表达

4 讨论

骨质疏松症属于中医学“骨枯”“骨痿”“骨极”范畴，其发生主要与肝脾肾三脏功能失常关系密切［4-5］。中医认为，脾为后天之本，气血生化之源，其运化水谷精微以濡养躯体，脾运化功能失常，则会导致肌肉萎缩，骨骼失养，导致骨痿；肝藏血主筋，肾藏精主骨，肝肾功能正常，则骨生长发育正常，肝肾功能异常，则会导致骨痿［6］。肝血虚则筋脉失养，肢体屈伸不利，气血不足会导致血液运行迟缓而成瘀血，导致骨失濡养，而肾精亏虚导致骨骼失养，最终导致骨痿。因此，骨痿的病因病机是肝肾亏虚、血瘀［7］，其治疗原则是补肝肾、强筋骨、活血化瘀［8］。

阳和汤出自清代王维德的《外科证治全生集》，主治阳虚寒凝之贴骨疽、脱疽、流注等疾病。方中鹿角胶温肾阳、益精血、壮筋骨，炮姜、肉桂温阳散寒，熟地滋阴养血、填精补髓，白芥子温阳通络，麻黄宣通经络，全方共奏温肾阳、补气血、散寒通滞之功。

江西中医药大学附属医院许鸿照名老中医在阳和汤原方基础上加鸡血藤、木瓜、防己组成加味阳和汤在临床上治疗膝骨性关节炎，取得了良好的疗效，相关的临床研究也证实了其可以延缓关节软骨的退变［9-10］。杨凤云教授根据骨质疏松症患者与膝骨性关节炎患者病因病机相似之处，在临床上运用该方治疗骨质疏松症，获得了理想的疗效。

现代研究也表明加味阳和汤能治疗骨质疏松症，如刘文源［11］运用阳和汤治疗60例骨质疏松患者，有效率达93.85%；陈墨川等［12］运用加味阳和汤治疗49例骨质疏松肾阳虚患者，有效率达87.76%。且研究表明加味阳和汤中鹿角胶能抑制骨吸收、延缓骨丢失和溶解的作用［13］，熟地具有抗疲劳和强壮的作用［14］。

在本研究中，CCK8法显示5%、10%、20%浓度的加味阳和汤血清对细胞活性无明显影响，而40%浓度的血清明显抑制细胞活性，说明40%浓度的含药血清可能对细胞产生毒性，因此在本实验中选用5%、10%、20%作为实验干预浓度。

抗酒石酸酸性磷酸酶是酸性磷酸酶的6种同工酶中的一种，是破骨细胞的特征性酶［15-16］。破骨细胞会分泌抗酒石酸酸性磷酸酶［17］，因此在诱导RAW264.7细胞形成OC时，可检测RAW264.7组各组细胞上清中抗酒石酸酸性磷酸酶的TRAP值来验证加味阳和汤对OC的作用，通过本研究也说明加味阳和汤能抑制OC的形成。

NF-κB信号通路是OC形成过程中一条重要的信号通路。在静息条件下，NF-κB与其抑制性蛋白组成三聚体呈非活性状态［18］，当RAW264.7细胞加入M-CSF和RANKL诱导后，会激活NF-κB信号通路，使IκB-α发生解离，核心蛋白p65蛋白由细胞质转移至细胞核中［19-20］。

本研究通过WB法检测各组细胞核p65蛋白表达，发现诱导组细胞核p65蛋白表达显著增加，表明RAW264.7细胞经M-CSF和RANKL诱导后，NF-κB信号通路被激活，p65进入细胞核，而加味阳和汤组p65蛋白表达下降，表明加味阳和汤能抑制p65因子的入核。诱导组细胞质IκB-α蛋白表达降低，表明加入诱导因子刺激后IκB-α蛋白发生了磷酸化，蛋白发生降解，而含药血清组IκB-α蛋白表达增加，说明加味阳和汤能抑制IκB-α蛋白的磷酸化，通过两方面说明了加味阳和汤能抑制NF-κB信号通路。

因此，本实验表明5%、10%、20%浓度的加味阳和汤不抑制RAW264.7细胞活性；加味阳和汤能抑制NF-κB的激活，抑制p65的入核和IκB-α的磷酸化，各组之间存在剂量依赖性，20%浓度的加味阳和汤血清抑制效果最强。