徐长卿对溃疡性结肠炎模型大鼠核因子κB信号通路的影响

贺海辉 沈洪

摘要 目的：從炎症反应探讨徐长卿治疗溃疡性结肠炎（UC）的机制。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为6组：正常组，模型组，柳氮磺吡啶组，徐长卿低、中、高剂量组。除正常组外，其余5组大鼠均以三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠造模。灌肠24 h后，徐长卿低中高剂量组分别每天给予徐长卿0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg体质量灌胃，柳氮磺吡啶组给予柳氮磺吡啶0.6 g/kg体质量灌胃，连续10 d。给药结束后，检测结肠组织髓过氧化物酶（MPO）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性，Western Blotting法检测磷酸化核因子κB抑制蛋白（p-IκBα）、胞质核因子κB（NF-κB）、胞核核因子κB蛋白水平。结果：徐长卿组较模型组MPO、iNOS活性显著降低（P<0.01），且随徐长卿剂量升高MPO、iNOS活性有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。徐长卿组与模型组比较p-IκBα、胞核核因子水平显著降低（P<0.01），且随徐长卿剂量升高p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趋势（P>0.05）。徐长卿组与模型组比较胞质核因子κB水平显著升高（P<0.01），且随徐长卿剂量升高胞质核因子κB水平有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：徐长卿通过抑制核因子κB信号通路的激活，减少炎症介质的生成，是其治疗溃疡性结肠炎的可能机制。

关键词 徐长卿;2，4，6-三硝基苯磺酸;溃疡性结肠炎;炎症反应;核因子κB;核因子κB抑制蛋白;髓过氧化物酶;诱导型一氧化氮合酶

Effects of Cynanchum Paniculatum on NF-κB Signaling Pathway in Ulcerative Colitis Model Rats

HE Haihui1，SHEN Hong2

（1 Hunan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital，Zhuzhou 412000，China; 2 Jiangsu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Cynanchum paniculatum in the treatment of ulcerative colitis.Methods：A total of 60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：a normal group，a model group，a sulfasalazine group，a low，a medium and a high dose of Cynanchum paniculatum group.Except the normal group，TNBS enema was used in the other 5 groups.After 24 h of enema，the low，medium and high dose groups were given 0.4 g/kg，0.8 g/kg and 1.6 g/kg of Cynanchum paniculatum by gavage every day，and the sulfasalazine group was given 0.6 g/kg of sulfasalazine by gavage for 10 days.After administration，the activities of MPO and iNOS in colon tissue were detected，and p-IκBα，Cytoplasmic NF-κB，Nuclear NF-κB protein level was detected by Western Blotting.Results：the activities of MPO and iNOS in Cynanchum paniculatum group were significantly lower than those in model group（P<0.01），and the activities of MPO and iNOS decreased with the increase of Cynanchum paniculatum dose（P>0.05）.Compared with the model group，the levels of p-IκBα and Cytoplasmic NF-κB of Cynanchum paniculatum group were significantly lower（P<0.01），and the levels of p-IκBα，Nuclear NF-κB decreased with the increase of the dosage of Cynanchum paniculatum（P>0.05）.Compared with the model group，the level of cytoplasmic NF-κB in Cynanchum paniculatum group increased significantly（P<0.01），and the level of cytoplasmic NF-κB increased with the increase of the dose of Cynanchum paniculatum（P>0.05）.Conclusion：The possible mechanism of Cynanchum paniculatum in treating ulcerative colitis is to inhibit the activation of NF-κB signaling pathway and reduce the production of inflammatory factors.

Keywords Cynanchum paniculatum; 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid; Ulcerative colitis; Inflammatory reaction; NF-κB; IκBα; MPO; iNOS

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.009

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是重要的结肠癌前病变和难治性疾病，其病因可能与环境、遗传、肠道菌群和免疫因素等有关，其中肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在UC发病中起重要作用，而核因子κB（NF-κB）是炎症反应的中心环节，以徐长卿为主的中药复方能有效治疗UC患者和动物模型[1-7]。我们前期动物实验表明徐长卿能有效改善三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇法诱导的大鼠结肠炎，其机制可能与降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平有关[8]。为进一步阐明徐长卿治疗溃疡性结肠炎的作用机制，本研究徐长卿对溃疡性结肠炎模型大鼠NF-κB信号通路及炎症介质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性8周龄SD大鼠60只，体质量（202±5）g，无特定病原体（SPF级），由南京大学动物模型研究中心提供，许可证号：SYXK（苏）2007-0017，饲养于江苏省中医院药理实验室，普通饲料，常规饮水，室温控制在22 ℃左右，相对湿度约60%，在严格遵循动物伦理学标准的前提下进行实验。

1.1.2 药物 徐长卿（亳州市敬德药业有限责任公司，批号：20100102）;柳氮磺吡啶片（上海三维制药有限公司，批号：200805C04）。

1.1.3 试剂与仪器 5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司，美国，货号：080M5000）;10%水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司，批号：20090922）;无水乙醇（南京宁试化学试剂有限公司，批号：20100118）;髓过氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所，批号：20161223）;一氧化氮合成酶（iNOS）（南京建成生物工程研究所，批号：20161218）;细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0028）;Western及IP细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0013）;BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国，批号：PG201361）;p-IκBα抗体（Abcam公司，英国：货号：13904）;NF-κB抗体（CST公司，美国，货号：8242）;GAPDH抗体（Abcam公司，英国，货号：8245）;H3抗体（上海碧云天生物技术有限公司，货号：AF0009）。电子天平（Sartorius公司，德国，型号：BT323S）;高速冷冻离心机（Beckman公司，美国，型号：GS-15R）;电泳槽（Biorad公司，美国，型号：Mini Protean 3 Cell）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只大鼠按体质量采用随机数字表法分成6组：正常组、模型组、徐长卿低剂量组、徐长卿中剂量组、徐长卿高剂量组、柳氮磺吡啶组，每组10只。模型建立参照前期预实验和相关文献[9-10]，除正常组外，其余50只大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，用大鼠灌胃针管由肛门轻缓插入约8 cm，缓慢推入造模液（100 mg/kgTNBS+50%乙醇0.25 mL），并保持倒立30 s后，仰卧归笼。正常组给予相应体积的生理盐水灌肠。

1.2.2 给药方法 分别称取中药饮片徐长卿8 g、16 g、32 g，用蒸馏水浸泡于500 mL烧杯中2 h后，分煎3次，合并3次煎液，加热浓缩至200 mL，过滤去渣，密封保存在4 ℃冰箱。生药浓度分别为0.04 g/mL、0.08 g/mL、0.16 g/mL。柳氮磺吡啶片用时用研钵研成细末，用双蒸水配成药物浓度为0.06 g/mL的水溶液。灌肠24 h后，正常组及模型组每天给予生理盐水10 mL/kg灌胃，徐长卿低、中、高剂量组给予相应徐长卿水煎液10 mL/kg灌胃（徐长卿人体推荐日用量为10 g，大鼠实验分别设人体推荐量的2.5倍、5倍、10倍，大鼠给药剂量0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg体质量，设为低、中、高剂量），柳氮磺吡啶组给予柳氮磺吡啶水溶液10 mL/kg灌胃（柳氮磺吡啶人体推荐日用量为4 g，大鼠实验设人体推荐量的10倍，大鼠给药剂量0.6 g/kg体质量），连续10 d。灌胃结束后，所有动物禁食24 h，脱颈椎法处死大鼠，采集大鼠结肠组织备检。

1.2.3 检测指标与方法

大鼠结肠组织MPO、iNOS活性检测：将收集的大鼠结肠组织，精确称重后，用眼科剪剪碎，使用匀浆器匀浆，转移到EP管中4 ℃ 2 500 r/min，离心半径10 cm，离心5 min，收集细胞并检测MPO、iNOS活性。严格按照试剂盒说明书的操作方法进行操作，检测结肠组织中的MPO、iNOS活性。

Western Blotting法检测p-IκBα、胞质核因子κB、胞核核因子κB蛋白：取结肠组织充分研磨，根据Western及IP細胞裂解液说明书的操作步骤提取组织总蛋白，根据细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒说明书的操作步骤提取细胞的胞质、胞核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各孔取40 μg的蛋白上样，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳进行蛋白分离，采用电转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，用TBST洗膜，加入一抗孵育，4 ℃反应过夜。次日先以TBST洗膜，加入二抗孵育，室温反应1 h，再用TBST洗膜，显色，采集图片。采用Image J图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析，以p-IκBα、胞质核因子κB与内参GAPDH条带灰度值之比及胞核核因子κB与内参H3条带灰度值之比作为各自目的蛋白相对含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布者，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布者，组间比较采用独立样本的Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织MPO、iNOS活性 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织MPO、iNOS活性显著升高（P<0.01）。与模型组比较，4个观察组大鼠结肠组织MPO、iNOS活性显著降低（P<0.01）。与柳氮磺吡啶组比较，徐长卿3种剂量组大鼠结肠组织MPO、iNOS活性差异无统计学意义（P>0.05）。徐长卿3种剂量组间大鼠结肠组织MPO、iNOS活性差异无统计学意义（P>0.05），但随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织MPO、iNOS活性有降低趋势。见表1。

2.2 结肠组织p-IκBα、胞质核因子κB、胞核核因子κB水平 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，4个观察组大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平显著降低（P<0.01）。与柳氮磺吡啶组比较，徐长卿3种剂量组大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平差异无统计学意义（P>0.05）。徐长卿三剂量组间大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平差异无统计学意义（P>0.05），但随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趋势。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织胞质核因子κB水平显著降低（P<0.01）。与模型组比较，4个观察组大鼠结肠组织胞质核因子κB水平显著升高（P<0.01）。与柳氮磺吡啶组比较，徐长卿3种剂量组大鼠结肠组织胞质核因子κB水平差异无统计学意义（P>0.05）。徐长卿3种剂量组间大鼠结肠组织胞质核因子κB水平差异无统计学意义（P>0.05），但随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织胞质核因子κB水平有升高趋势。见表2。

3 讨论

《沈氏尊生书》有云：“大抵痢之疡根，皆由湿蒸热壅，以至气血凝滞，渐至肠胃之病。”UC湿热蕴结肠道，胃肠腑气不利，气血运行受阻，气血凝滞，血瘀夹湿夹热，伤及肠络出血，而致腹痛、里急后重、痢下血性黏液便。因此，湿热蕴肠、气滞血瘀为UC基本病机[11]。UC风邪伤中，运化失司，风水相作发为肠鸣、泄泻;肠腑之风居无定所，伤及肠络，则间歇性发作，腹痛绵绵，痛无定处;风木壅滞，气机失调，升降失常，中焦气阻，风气相求而生腹胀腹痛;外风化热侵及肠脂，热盛则肉腐，肉腐则有脓;风入血，则血随风走窜，妄行下血。因此，UC属于中医“肠风”等范畴[12]。

关于徐长卿的功效，广州部队《常用中草药手册》曰：“祛风止痛，解毒消肿，温经通络……”《吉林中草药》曰：“镇静止痛，驱寒散瘀，通络和血……”徐长卿具有祛风化湿、活血通络止痛之功[1，13]，正切合UC的病机，故可用来治疗UC。

夏翔每遇UC，最喜用徐长卿，配合辨证加减，臨床效果良好[1]。陈彤君等[2]予以愈疡汤（白头翁、穿山龙、败酱草、徐长卿、仙鹤草等）口服治疗UC疗效确切。杨杰等[3]予以“理肠汤”（党参、薏苡仁、徐长卿、赤石脂、椿根皮、炒白术、白及、诃子、蒲黄、槐花、三七、甘草）口服及“溃疡灵”保留灌肠治疗UC有较好的临床疗效，能够显著改善患者的症状，促进病变肠道修复。赵方方[4]予以中药（黄柏、地榆炭、生黄芪、延胡索、白及、徐长卿、三七粉、血竭）保留灌肠治疗UC疗效较好。宋治学和王琪[5]采用辨证分型用药及外用灌肠方（青黛、黄柏、党参、徐长卿、五倍子、枯矾、赤石脂、三七等）治疗UC具有提高机体免疫力、恢复肠细胞功能，达到炎症消失、溃疡愈合、腹泻停止的特点。康正祥等[6]用肠安冲剂（生黄芪、杭白菊、徐长卿、煨木香、红藤）治疗TNBS/乙醇法制成的UC模型大鼠，各种症状明显减轻，T淋巴细胞亚群趋以正常，抗氧化能力提高，镜检结肠溃疡与出血点减少。焦君良等[7]用溃结康胶囊（黄精、灵芝、忍冬藤、青黛、徐长卿、白花蛇舌草等）能改善结肠黏膜组织致敏法诱导的UC模型大鼠，疗效机制与其免疫调节和抗自由基的作用有关。我们的前期实验研究也表明，徐长卿能改善TNBS/乙醇法诱导的结肠炎大鼠体质量、疾病活动指数（DAI）、结肠大体形态损伤及组织病理学，降低结肠组织TNF-α、IL-1β水平[8]。

肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应对UC的发生发展起着十分重要的作用。UC肠道特异性免疫细胞、非特异性免疫细胞及非免疫细胞（如上皮细胞、血管内皮细胞等）免疫炎症反应，释放一系列炎症介质和细胞因子，包括TNF、IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、花生四烯酸、神经肽、NO、细胞黏附分子等，它们彼此诱生、增减，相互协同或拮抗，形成复杂的网络，并逐级扩大和慢性化，使炎症反应持续并加重，肠黏膜受损而出现一系列临床表现[14-15]。

MPO富含于中性粒细胞中，是中性粒细胞的功能和激活标志，其水平及活性变化代表着中性粒细胞的功能和活性状态。NOS是NO合成的限速酶，iNOS主要存在于单核/巨噬细胞系统，主要通过生成NO而发挥其生物学作用，检测此酶可间接反映NO的水平。本实验结果显示，模型组大鼠结肠组织MPO、iNOS活性显著高于正常组，经徐长卿治疗后MPO、iNOS活性显著降低，且随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织MPO、iNOS活性有降低趋势。

核因子κB是一类能与多种基因启动子部位κB位点发生特异性结合促进转录的蛋白质，在炎症和免疫反应中具有重要作用[16]。炎症介质、细胞因子、细菌脂多糖等可以激活核因子κB[17-18]，而多种炎症介质的启动子部位都有核因子κB位点，它是细胞因子、炎症介质释放的关键调控因素，是肠道免疫反应中重要的调节基因，它的激活能够促进炎症介质的表达，极大地影响了黏膜炎症的发生过程，显著地诱导了UC的发生[19-20]。

核因子κB与IκB、核因子κB抑制剂激活酶（Inhibitory Kappa B Kinase，IKK）是核因子κB信号通路的主要分子。静息状态的核因子κB与IκB形成复合物，存在于胞质中。当细胞被激活后，IKK促进IκB磷酸化并与核因子κB解离，释放核因子κB，游离的核因子κB由细胞质进入细胞核中，与靶DNA结合，促进下游基因的表达。本实验结果显示，模型组大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平显著高于正常组，经徐长卿治疗后p-IκBα、胞核核因子κB水平显著降低，且随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织p-IκBα、胞核核因子κB水平有降低趋势。模型组大鼠结肠组织胞质核因子κB水平显著低于正常组，经徐长卿治疗后胞质核因子κB水平显著升高，且随徐长卿剂量升高大鼠结肠组织胞质核因子κB水平有升高趋势。

综上所述，徐长卿通过降低TNBS诱导的大鼠结肠炎p-IκBα、胞核核因子κB水平，升高胞質核因子κB水平，抑制核因子κB信号通路的激活，从而降低MPO、iNOS活性，减少炎症介质的生成，修复肠黏膜。

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（2021-04-25收稿 本文编辑：刘强）