穿心莲内酯对胰腺癌细胞顺铂敏感性的作用机制研究

张铃枝 王楠 杨丽芳 廷荃 杨卜瑞

摘要 目的：探討穿心莲内酯对胰腺癌细胞顺铂敏感性的作用和机制。方法：将人胰腺癌细胞SW1990分成对照组、穿心莲内酯组（穿心莲内酯处理）、顺铂组（顺铂处理）、穿心莲内酯+顺铂组（穿心莲内酯、顺铂处理）、穿心莲内酯+顺铂+转化生长因子-β1（TGF-β1）组（穿心莲内酯、顺铂、TGF-β1处理）、TGF-β1组（TGF-β1处理），Western Blotting检测TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达，MTT检测增殖，流式细胞术检测凋亡，Transwell小室检测侵袭和迁移。结果：与对照组比较，穿心莲内酯组胰腺癌细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达量减少（P<0.05），TGF-β1组胰腺癌细胞p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达量增多（P<0.05）。与对照组比较，穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞增殖活性减少，凋亡率增多，细胞侵袭和迁移数目降低（P<0.05）。与穿心莲内酯组、顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞增殖活性减少，凋亡率增多，细胞侵袭和迁移数目降低（P<0.05）。与穿心莲内酯+顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组胰腺癌细胞增殖活性增多，凋亡率减少，细胞侵袭和迁移数目增多（P<0.05）。结论：穿心莲内酯通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路提高胰腺癌细胞对顺铂敏感性。

关键词 穿心莲内酯;胰腺癌;顺铂;TGF-β1/Smad2/3信号;侵袭;迁移;凋亡;增殖

Mechanism of the Sensitivity of Cardiac Linolestide Route to Cisplatin in Pancreatic Cancer Cells

ZHANG Lingzhi1，WANG Nan2，YANG Lifang3，LI Tingquan3，YANG Burui1

（1 Shanxi University of Traditional Chinese Medicine Clinical Sciences，Taiyuan 030024，China; 2 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China; 3 Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China）

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of andrographolide on the sensitivity of pancreatic cancer cells to cisplatin.Methods：Human pancreatic cancer cells SW1990 were divided into a control group，an andrographolide group（andrographolide treatment），cisplatin group（cisplatin treatment），an andrographolide+cisplatin group（andrographolide，cisplatin treatment），andrographolide+cisplatin+transforming growth factor β1（TGF-β1） group（andrographolide，cisplatin，TGF-β1 treatment），a TGF-β1 group（TGF-β1 treatment），Western blot detection of TGF-β1，p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein expression，MTT detection of proliferation，flow cytometry detection of apoptosis，Transwell chamber detection of invasion and migration.Results：Compared with the control group，TGF-β1，p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein expression in pancreatic cancer cells in the andrographolide group decreased（P<0.05）.Compared with the control group，the expression of p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein in pancreatic cancer cells in the TGF-β1 group increased（P<0.05）.Compared with the control group，pancreatic cancer cell proliferation activity decreased，apoptosis rate increased，the number of cell invasion and migration decreased in andrographolide group，cisplatin group，and andrographolide+cisplatin group（P<0.05）.Compared with the andrographolide group and the cisplatin group，the pancreatic cancer cell proliferation activity in the andrographolide+cisplatin group decreased，and the apoptotic rate increased，the number of cell invasion and migration decreased（P<0.05）.Compared with andrographolide+cisplatin group，pancreatic cancer cell proliferation activity increased，apoptosis rate decreased，the number of cell invasion and migration increased in andrographolide+cisplatin+TGF-β1 group（P<0.05）.Conclusion：Andrographolide can increase the sensitivity of pancreatic cancer cells to cisplatin by inhibiting the TGF-β1/Smad2/3 signaling pathway.

Keywords Andrographolide; Pancreatic cancer; Cisplatin; TGF-β1/Smad2/3 signal; Invasion; Migration; Apoptosis; Proliferation

中图分类号：R284;R735文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.008

胰腺癌属于消化系统恶性肿瘤，早期临床症状不明显，5年生存率极低，顺铂是常用化疗药物，提高胰腺癌对顺铂的敏感性具有重要意义[1]。穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分，其属于二萜内酯类的化合物，有调控免疫、抗炎、抗病毒等作用[2]。穿心莲内酯有抗肿瘤作用，对胃癌等有抑制作用[3-4]。穿心莲内酯还可以提高胰腺癌吉西他滨治疗效果[5]。目前尚不清楚穿心莲内酯对胰腺癌顺铂敏感性的影响。本实验探讨穿心莲内酯对胰腺癌细胞SW1990顺铂敏感性的影响及机制，为提高胰腺癌患者顺铂敏感性提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胰腺癌细胞SW1990，通派（上海）生物科技有限公司提供。

1.1.2 药物 穿心莲内酯滴丸（天士力医药集团股份有限公司，批号：20200315）;顺铂注射液（诺欣）（江苏豪森药业集团有限公司，批号：20200224）。

1.1.3 试剂与仪器 TGF-β1（ACROBiosystems公司，美国，货号：TG1-H4212）;兔抗TGF-β1抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美國，货号：sc-130348），兔抗Bax抗体（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：FNab10410）;兔抗Bcl-2抗体（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：2876），兔抗E-cadherin抗体（Thermo公司，美国，货号：33-4000），兔抗N-cadherin抗体（Thermo公司，美国，货号：MA5-15633），兔抗Smad3抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF6362），兔抗MMP-9抗体（武汉博欧特生物科技有限公司，货号：orb97357），兔抗p-Smad2抗体（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：3101），兔抗p-Smad3抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF3363），兔抗MMP-2抗体（GeneTex公司，美国，货号：GTX25704），兔抗Smad2抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF6497），酶标仪（北京悦昌行科技有限公司，SpectraMax Plus 384型），流式细胞仪（贝克曼库尔特公司，美国，CytoFLEX型），倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司，XDS-900型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 将胰腺癌细胞分成对照组、穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组、穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组、TGF-β1组，对照组细胞按照常规方法培养，穿心莲内酯组用6 μmol/L的穿心莲内酯处理，顺铂组用0.5 μg/mL的顺铂处理[6]，穿心莲内酯+顺铂组用6 μmol/L的穿心莲内酯和0.5 μg/mL的顺铂处理，穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组用6 μmol/L的穿心莲内酯、0.5 μg/mL的顺铂、2 ng/mL的TGF-β1处理[7]，TGF-β1组用2 ng/mL的TGF-β1处理。胰腺癌细胞培养液为含有10%胎牛血清的DMEM，在细胞培养液中同时添加1%的青链霉素，细胞培养参数为：饱和湿度、37 ℃、5%CO2、95%空气。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 MTT检测细胞增殖 胰腺癌细胞接种到96孔板内，每个孔中添加5 000个细胞，分别在细胞中加入0、3、6、12、24、48 μmol/L的穿心莲内酯，或者按照对照组、穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组、穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组分组处理，细胞培养24 h后，在细胞中添加10 μL的MTT，放在37 ℃孵育4 h。弃掉上清，添加150 μL的二甲基亚砜，继续反应10 min，用酶标仪测定450 nm的OD值。OD值表示细胞增殖活性。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.2.2 Western Blotting检测蛋白表达 胰腺癌细胞接种到12孔板内，按照对照组、穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组、穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组、TGF-β1组处理，细胞培养24 h后，分别提取细胞总蛋白，并将蛋白样品和5×上样缓冲液混合，放在100 ℃煮沸5 min。利用10%分离胶、5%浓缩胶进行电泳，每孔上样40 μg蛋白，首先以90 V电压电泳，观察蓝色染料即将进入分离胶时，调整为110 V继续电泳。在4 ℃条件转膜，转膜时间为1.5 h，转膜电压为100 V。将NC膜用5%牛血清白蛋白封闭以后，置于一抗稀释液内，在4 ℃过夜。然后将NC膜放在二抗稀释液内，在室温结合1.5 h。TGF-β1、Bax、Bcl-2、上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9一抗按照1∶1 200稀释，p-Smad2、p-Smad3一抗按照1∶1 000稀释，Smad2、Smad3一抗按照1∶800稀释。二抗按照1∶4 000稀释。ECL发光。GAPDH作为参照，根据条带的灰度值计算目的蛋白表达变化。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.2.3 流式细胞术检测凋亡 胰腺癌细胞接种到12孔板内，按照对照组、穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组、穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组处理，24 h后，每个检测样品收集106个细胞，悬浮在500 μL结合缓冲液中，添加10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，在室温条件下结合15 min。用流式细胞仪检测。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.2.4 Transwell小室检测细胞侵袭、迁移 细胞侵袭实验首先需要用基质胶湿化小室，其余步骤相同。将胰腺癌细胞用不含血清的细胞培养液悬浮（密度为5×106个/mL），吸取100 μL的细胞悬浮液添加到小室的上室，在下室内添加600 μL的含血清细胞培养液，放在37 ℃培养24 h。将没有穿膜的细胞擦掉，无水乙醇固定，结晶紫染色，在显微镜下观察细胞穿膜数目，随机选择5个视野，结果取均值。每组设置3個复孔，实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 穿心莲内酯对胰腺癌细胞增殖的影响 与0 μmol/L比较，6、12、24、48 μmol/L穿心莲内酯处理后胰腺癌细胞增殖活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）。12 μmol/L穿心莲内酯处理后胰腺癌细胞成活率接近50%，选择6 μmol/L的穿心莲内酯做后续实验。见表1。

2.2 穿心莲内酯抑制胰腺癌细胞中TGF-β1/Smad2/3信号激活 与对照组比较，穿心莲内酯组胰腺癌细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，TGF-β1组胰腺癌细胞p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1～2，表2～3。

2.3 穿心莲内酯调控TGF-β1/Smad2/3增强顺铂抗胰腺癌细胞增殖和诱导凋亡作用 与对照组比较，穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达量减少，凋亡率和Bax蛋白表达量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯组、顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达量减少，凋亡率和Bax蛋白表达量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯+顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组胰腺癌细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达量增多，凋亡率和Bax蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3～4，表4。

2.4 穿心莲内酯调控TGF-β1/Smad2/3增强顺铂抗胰腺癌细胞EMT作用 与对照组比较，穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞E-cadherin蛋白表达量增多，N-cadherin蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯组、顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞E-cadherin蛋白表达量增多，N-cadherin蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯+顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组胰腺癌细胞E-cadherin蛋白表达量减少，N-cadherin蛋白表达量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5和表5。

2.5 穿心莲内酯调控TGF-β1/Smad2/3增强顺铂抗胰腺癌细胞侵袭和迁移作用 与对照组比较，穿心莲内酯组、顺铂组、穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞侵袭和迁移数目降低，MMP-2、MMP-9蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯组、顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂组胰腺癌细胞侵袭和迁移数目降低，MMP-2、MMP-9蛋白表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与穿心莲内酯+顺铂组比较，穿心莲内酯+顺铂+TGF-β1组胰腺癌细胞侵袭和迁移数目增多，MMP-2、MMP-9蛋白表达量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6，表6。

3 讨论

胰腺癌作为常见的恶性肿瘤，其具有转移速度快、发展迅速等特点[8]。顺铂是临床常见化疗药物，具有天然的抗肿瘤活性，可抑制肿瘤细胞增殖、转移，促进细胞凋亡[9]。Bcl-2、Bax是细胞凋亡的标志蛋白，其均属于Bcl-2蛋白家族成员[10]。肿瘤转移的基础条件之一是降解细胞外基质，MMPs是细胞外基质降解酶，其蛋白成员MMP-2、MMP-9表达改变与肿瘤细胞迁移、侵袭有关[11]。EMT是指上皮特征逐渐消失而间质特征逐渐明显的过程，肿瘤细胞EMT发生于肿瘤转移之前，EMT后的细胞转移能力明显增加[12]。E-cadherin是上皮细胞标志蛋白，N-cadherin是间质细胞标志蛋白，二者表达变化是EMT改变的重要参考指标[13]。在肿瘤进展中，TGF-β1/Smad2/3等信号通路参与其中，TGF-β1活化后可在细胞表面与TGF-β1受体结合，促进下游Smad2/3磷酸化，进而影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移，TGF-β1/Smad2/3在胰腺癌进展中发挥促进作用，二甲双胍可通过抑制TGF-β1活性降低胰腺癌侵袭[7，14-15]。

穿心莲内酯有凉血消肿、保肝利胆、抗糖尿病等作用，提取于中药穿心莲[16]。穿心莲内酯对肿瘤有抑制作用，穿心莲内酯可在体外抑制卵巢癌、骨肉瘤等肿瘤细胞增殖、侵袭，并促进细胞凋亡[17-19]。研究发现，穿心莲内酯和化疗药物吉西他滨联合治疗较单纯一种药物治疗效果更好[5]。本实验显示，穿心莲内酯和顺铂均可以降低胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，抑制MMP-2、MMP-9、Bcl-2、N-cadherin蛋白表达，促进E-cadherin、Bax表达，并且二者联合效果更明显，这提示穿心莲内酯能够增强顺铂抗胰腺癌作用。本实验还发现，穿心莲内酯降低胰腺癌细胞中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表达量，并且TGF-β1可部分逆转穿心莲内酯对顺铂抗胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡的增强作用，说明穿心莲内酯通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号提高胰腺癌细胞顺铂敏感性，穿心莲内酯可能是提高胰腺癌患者化疗药物敏感性的药物之一。本研究存在一定的局限性，仅初步在细胞中证明了穿心莲内酯的作用，尚未在体内和临床应用中进行广泛验证，以后会继续探讨穿心莲内酯提高胰腺癌顺铂敏感性的临床应用可能。体外细胞实验中，在一定范围内的药物抗肿瘤作用强弱与药物作用浓度有关，且在本研究中，只选择了一种作用浓度的穿心莲内酯、顺铂进行了联合处理，没有对比穿心莲内酯和顺铂抗癌作用强弱，这部分内容会在以后实验中进行探讨。

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（2021-11-25收稿 本文编辑：杨觉雄）