黑龙江省某牧场奶牛乳汁体细胞数与乳脂率相关性的研究

龙全梅，张天琦，王建发

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院/黑龙江省牛病防制重点实验室，大庆 163319）

奶牛乳房炎是指奶牛乳房组织发生炎症性病变，通常分为临床型和亚临床型。临床型表现为奶牛乳房胀痛，甚至皮肤破溃、体温升高、食欲不振、精神沉郁、乳汁成分改变、分泌减少，有时由于感染病原菌不同，气味和颜色也会出现变化。亚临床型是乳房组织的慢性炎症，病因复杂难以治愈。亚临床型通常没有临床型所具有的红肿热痛、机能变化等明显的特征，但乳汁的成分改变，细菌数量改变，体细胞数增加[1-2]。体细胞数（Somatic Cell Count，SCC）是指牛乳中约98%的白细胞以及2%的脱落的乳腺上皮细胞。SCC被广泛用作亚临床乳腺内感染（Intramammary Infection，IMI）的一种诊断指标，并且是乳房健康管理方案的基础。当SCC数量超过50万·mL-1时通常认为乳房受到外伤或由细菌、病毒入侵乳房引发炎症[3]。细菌侵入是导致乳腺内感染的主要因素，细菌释放毒素，导致大量的免疫细胞被激活，随着血液进入乳房损害乳房组织，引发乳房的炎症。随后免疫细胞随乳汁分泌，导致牛奶中的体细胞数增加。而随着体细胞数增加脂肪酶也会增加，增加的脂肪酶分解脂肪，产生腐败酸味，破坏乳酸菌生存环境，从而影响牛奶的质量和产量[4-5]。

乳脂肪是由乳腺上皮细胞从血液吸收长链脂肪酸合成分泌于乳汁中的一种高质量易消化的天然脂肪，由99%的甘油三酯还含有约1%的磷脂、胆固醇、糖脂、游离脂肪酸以及脂溶性维生素等混合物组成。其中乳脂肪酸88%源于饲料脂肪，12%来自于内源脂肪。乳脂率是衡量乳汁的营养价值和乳品质优劣的重要指标之一，在同一牧场奶牛乳脂率主要受到奶牛品种、日粮成分以及奶牛健康态的暴饷，排除品种差异暴饷，日粮成分固定的情况下，奶牛健康态的个体差异决定了感染的发展过程以及结果。一方面外伤感染以及细薗、病毒的感染导致白细胞分必大里的促炎因子，另一方面白细胞的迁移也导致炎症的进一步发展。研究表明将原料牛奶进行巴氏消毒后于低温保存，高SCC牛奶中乳脂和乳蛋白的降解率均明显上升，货架期大幅缩短[6-7]。体细胞数作为奶牛健康状态监测的基础指标，与奶牛健康状态强烈相关，那么体细胞数的变化对奶牛生产性能和牛奶品质又有怎样的影响呢？研究通过对体细胞数与乳脂率之间的相关性进行的较为详细地分析和研究，旨在了解体细胞数对乳脂率的影响，从乳房免疫与代谢的角度出发，为提高对奶牛免疫与代谢相互作用的理解以及提升我国乳品企业乳品品质和产量提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 乳样

于2020年8月对黑龙江省某规模化牧场通过牧场转盘式牛乳采样器采集全群荷斯坦成年奶牛当日的牛乳样品，按照采集奶样的规范，早∶中∶晚=4∶3∶3（日挤奶3次）的比例使用的采样瓶体积为50 ml，按照采样瓶体积的80%采集每头奶牛40 mL乳样，进行充分混匀[8]。新鲜样品按0.1 g/采样管添加重铬酸钾作为防腐剂，防腐剂与奶样充分混匀，4℃保存的奶样能使乳成分在7 d内保持稳定；未添加防腐剂的样品4℃仅能保存3 d，而在室温条件下仅能保存1～2 d。低温保存取出的样品须在两小时内进行乳成分分析测定。奶样采集结束，装箱后送至大庆市家畜繁育指导站DHI检测中心。检测乳脂先预热奶样，而奶样预热会使体细胞数明显降低，奶样预热前先测定体细胞数。

1.2 体细胞检测

利用SCC-100体细胞分析仪（丹麦福斯公司）进行体细胞计数。其计数原理为：利用碘化丙啶将细胞的DNA进行有效的染色以及防止乳液中的脂肪体以及胶原蛋白等物质被分解；体细胞荧光检测仪系统对含有经过染色的DNA的体细胞进行逐一识别。操作步骤为：专用的SCC采样卡盒容量为50μL，盒中装有荧光染色剂碘化丙啶。开机后将奶样吸入到采样装有荧光染色剂碘化丙啶的卡盒中，奶样和荧光染料充分混合，然后被送至检测腔室内进行细胞计数检测。按启动按钮开始检测，检测结果以及样本识别编号被连接的电脑自动记录，检测完毕进行数据的拷贝保存。

1.3 乳脂率检测

利用MilkoScan FT-20全乳分析仪（丹麦福斯公司）检验牛奶中的脂肪含量。其检测原理为：光源发出的光被分束器分为两束，一束经透射到达动镜，另一束经反射到达定镜。两束光分别经定镜和动镜反射再回到分束器，动镜以一恒定速度作直线运动，因而经分束器分束后的两束光形成光程差，产生干涉；干涉光在分束器会合后通过样品池，通过样品后含有样品信息的干涉光到达检测器，然后通过傅里叶变换对信号进行处理，然后得到透过率或吸收光谱图。操作步骤为：全乳分析仪开机之后要进行清洗和调零，采用标准样品检定仪器。上样量为5～25 mL可调节，通常标准为10 mL。DHI测定技术规范要求在检测前需要将奶样在42℃条件下水浴预热10～20 min，然后充分摇匀，以破坏该薄膜，释放出乳脂。吸取10 mL样品上样，按启动按钮开始检测，检测结果以及样本识别编号被连接的电脑自动记录。检测完毕进行数据的拷贝保存，关机之前进行清洗和调零。

1.4 数据处理

将所有数据按照国家生乳标准利用Excel表进行数据筛选，剔除乳脂率小于3.1%的奶样（GB 19301-2010）[9]，剔除体细胞数为0万·mL-1以及体细胞数大于500万·mL-1的无统计意义的样本，得到有效样本共834个。使用Graph pad Prism 8录入数据选择相关性分析、线性回归分析以及T检验分析进行统计，并采用平均值-标准差（Mean-SD）表示，r＞0.75认为有强烈的相关性，P＜0.05认为有显著的差异性。所有的图均来自Graph pad Prism 8。

2 结果与分析

2.1 体细胞数

体细胞数为1～50万·mL-1的样本数为781头，占总有效样本数的94%；体细胞数为51～500万·mL-1的样本数为53头，占总有效样本数的6%。可见，此牛场奶牛的体细胞数大多在体细胞数小于50万·mL-1的正常范围内，可能患有隐性乳房炎的奶牛较少，牧场综合管理得当。

2.2 体细胞数与乳脂率

牛乳中体细胞数与乳脂率相关性分析（图1）结果为，相关系数r=0.122 2，P=0.000 4，回归方程为：Y=0.002 914*X+4.329，表明乳脂率与体细胞数显著不相关。体细胞数小于50万·mL-1时平均乳脂率为4.36%，体细胞数超过50万·mL-1时平均乳脂率为4.69%，相差了0.33%，T检验分析（图2）结果为，P=0.006 2，表明体细胞数小于50万·mL-1与体细胞数超过50万·mL-1的样品乳脂率差异显著。体细胞数小于50万·mL-1与体细胞数超过50万·mL-1的样品产奶量T检验分析（图3）结果为，P=0.718 6，表明体细胞数小于50万·mL-1与体细胞数超过50万·mL-1的样品产奶量差异不显著。乳脂产量与体细胞数的相关性分析（图4）结果为，相关系数r=0.050 73，P=0.143 3，回归方程为：Y=0.000 816 0*X+1.692，表明乳脂产量与体细胞数显著不相关。另外产奶量与体细胞数相关性分析（图5）表明，相关系数r=-0.029 18，P=0.400 0，回归方程为：Y=-0.009 162*X+39.36，产奶量与体细胞数显著不相关。可见，此牛场牛乳中的乳脂率较为稳定。

图1 乳脂率与体细胞数相关性分析Fig.1 Correlation analysis of milk fat rate and somatic cell count

图2 体细胞数小于50万·mL-1与体细胞数超过50万·mL-1的样品乳脂率T检验分析Fig.2 T-test analysis of milk fat rate of samples with somatic cell count less than 500 000·ml-1 and somatic cell count more than 500 000·ml-1

图3 体细胞数小于50万·mL-1与体细胞数超过50万·mL-1的样品产奶量T检验分析Fig.3 Ttest analysis of milk yield of samples with somatic cell count less than 500 000·ml-1 and somatic cell count more than 500 000·ml-1

图4 乳脂产量与体细胞数相关性分析Fig.4 Correlation analysisof milk fat yield and somatic cell count

图5 产奶量与体细胞数相关性分析Fig.5 Correlation analysis of milk yield and milk fat ratesomatic cell count

3 讨论

奶牛乳房炎表现为奶牛乳房组织的炎症性反应，细菌是导致奶牛乳房炎的主要因素之一。细菌及其成分能够刺激奶牛乳腺产生炎症应答，也能导致代谢发生改变，这是个涉及免疫系统与代谢相互调节相互影响的复杂过程。这也许能够从部分疾病会使食欲减退、难以进食或是长期的营养不良导致许多疾病的易感性增加以及感染后机体羸弱的免疫系统无法抵抗感染中得到一些启示。研究表明在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的刺激下炎症细胞因子被激活，奶牛乳腺细胞的炎症细胞因子的mRNA表达增加。奶牛乳腺上皮细胞作为特化的具有泌乳功能的细胞，其泌乳功能被广泛研究，而许多的研究表明病原微生物刺激后乳腺上皮细胞具有免疫应答的功能[10-16]。炎症状态下的乳腺上皮细胞的能量不仅要维持基本物质的生产来合成乳汁还要支持细胞内免疫应答产生细胞因子。炎性细胞因子所调控的信号通路与代谢过程相互调节，从而表现为细胞的过度炎症应答导致的细胞损伤以及细胞的损伤导致的生物合成过程受阻。耿子健[17]、单旭菲[18]、张旭[19]等的研究表明的革兰氏阴性菌的成分LPS（Lipopolysaccharide）以及革兰氏阳性菌的成分LTA-sa（Staphylococcal Lipoteichoic Acid）的刺激所造的奶牛乳腺上皮细胞炎症体外模型中，炎症因子表达增加，乳脂、乳蛋白合成减少，进一步表明急性炎症能够影响细胞的生物合成过程。

正常情况下，牛奶中理想的乳汁体细胞数为：第一胎≤15万·mL-1，第二胎≤25万·mL-1，第三胎≤30万·mL-1，当SCC数量上升体细胞数量超过50万·mL-1时通常认为乳房受到外伤或由细菌、病毒入侵乳房引发炎症。数据分析结果表明乳中乳脂率与乳汁中的体细胞数显著不相关。后续的数据分析表明乳汁中的体细胞数小于50万·mL-1乳脂率并未随着体细胞的增加而变化，相关系数r=0.000 9，P=0.979 5，当乳汁中的体细胞数超过50万·mL-1时乳脂率与体细胞数的相关系数r=0.288 1，P=0.036 5。进一步表明乳汁中的体细胞数的高低对乳脂率没有影响。多数奶牛乳汁中的体细胞数小于50万·mL-1，高体细胞数的奶牛样本较少，可能是导致体细胞数的增加与乳脂率相关性不显著的原因。乳汁中的体细胞数超过50万·mL-1乳脂率并没有显著降低，从数据分析来看反而略有增加，我们推断部分奶牛的健康状态可能较好，奶牛乳腺自身的防御能力强，其健康强大的免疫系统克服感染消灭了细菌、病毒。这可能能够从组成体细胞的各个种类的细胞含量变化中得到一些启示，研究表明健康奶牛乳汁中巨噬细胞和淋巴细胞占多数，而细菌入侵导致中性粒细胞占比大大升高。显然，机体的健康状态是机体炎症发生发展以及克服感染的关键因素之一[20]。事实上，由细菌引起乳腺内感染是引起乳腺炎的主要原因之一，且乳腺内感染的存在以及所涉及的微生物类型是导致乳汁体细胞数变化的主要因素[21]，但25%～50%的乳汁中体细胞数高的奶样进行培养时并不会长出细菌，这可能也是由于机体克服了感染的原因。

金亚东等[22]、祝宇等[23]、Najafi等[24]以及张海平[25]的研究认为随着乳汁中的体细胞数的增多乳产量减少，乳脂率下降。而Jaeggi等[26]的研究表明当乳汁中的体细胞数在100万·mL-1以内，乳脂含量变化不显著，但当体细胞数超过100万·mL-1时乳脂率降低，这是由于乳汁中的体细胞数超过100万·mL-1时乳中的总固体含量（Total Solids）减少（脂肪含量=总固体含量－非脂肪固体含量）。Kul等[27]认为随着乳汁中体细胞数的增加乳脂率下降，这可以解释为乳腺上皮细胞合成脂肪的减少。王希春等[28]认为乳腺发生炎症时乳汁中的平均体细胞数增加，乳腺的损伤导致乳汁分泌受损，乳中乳脂率下降。Ma Y等[29]认为乳产量以及乳脂合成均减少，但高体细胞数与低体细胞数复合生乳中乳脂率并没有显著的变化。Azzara等[30]认为乳汁中具有高体细胞数的牛奶中巨噬细胞增多，巨噬细胞是乳中唯一分泌脂解酶的细胞，脂解酶导致乳汁中的乳脂加速分解，乳脂率降低。韩丽云等[31]的研究表明乳汁中的体细胞数和乳脂率之间相关性并不显著，P=0.295 1，回归方程为Y=0.064 3*X+3.985 7，随着体细胞数的增加产奶量下降，浓缩效应弥补了乳脂合成和分泌的降低，因此乳脂合成的变化被忽略。健康乳腺所分泌的乳汁中体细胞数多为乳腺脱落的上皮细胞，且乳汁中的体细胞数量在正常范围内，一旦出现乳腺感染，嗜中性粒细胞的数量可达到90%以上[32]。免疫系统克服感染，导致流入乳汁中的免疫细胞增多，这也是这部分奶牛乳汁中体细胞数高但其乳脂率并没有显著变化的原因。就牧场而言，高体细胞数的生乳与低体细胞数的生乳混合后，乳脂率与体细胞数均没有显著的变化。何芳等[33]的研究结表明乳脂率与体细胞数并没有显著相关性。张向阳等[34]表明在妊娠和泌乳期间，机体激素水平发生巨大变化，而激素的变化导致乳腺免疫系统发生适应性调整。Watanabe等[35]研究发现，TNF-α能抑制乳腺的泌乳功能，而TNF-α是在急性炎症过程中所产生的一种细胞因子。可见在乳房发生炎症的过程中，机体的营养物质需要用于免疫应答和生产合成。孙书函等[36]认为日粮中的各营养物质的合理配比能够保障动物矿物质代谢、繁殖性能、生长发育及脂类代谢等各种生理功能。但在临床实践中一昧的增加营养在乳房炎发生时是远远不够的，那么我们需要找到乳腺免疫应答和生产合成之间的关联，找到它们之间的平衡点，采用干预手段来解决炎症以及乳汁产量和质量降低的问题。

牧场管理的实时生产性能测定监测能够保证乳脂率以及乳产量的稳定，乳房炎的发生受诸多因素的影响，但最主要的还是取决于奶牛乳腺自身的防御能力，增强免疫力能有效地增加机体抗感染的能力，并降低疾病的易感性。乳汁中体细胞数量以及组成的变化与乳汁的产量和质量以及机体的健康状况之间的关联性是有待研究的问题。关于奶牛的自愈能力与奶品质之间的关联目前鲜有报道，以上均为根据此次实验数据得来的推论，期待学者们对此做详细的研究，以阐明乳腺炎状态下乳腺免疫系统怎样调控代谢从而影响奶品质。是否能从乳房健康与体细胞数之间明显的相关性，来研究隐性乳房炎时乳脂率高低在乳汁质量与产量中所表征的信息还有侍深入研究。明确这一问题对更全面的了解乳房生理病理学以及免疫学具有重要意义，可以为乳腺代谢途径与乳腺免疫功能相互调节的理论和方法建立基础，进一步为防控乳腺疾病提高牛乳营养品质提供一些新思路。可见，安全有效地提高乳脂率且保证乳品质仍然是当下的研究的首要目标。

4 结论

实验结果表明，奶牛乳汁乳脂率、乳脂产量以及产奶量与体细胞数不具有相关性。

体细胞数、乳脂率稳定在标准水平，乳脂产量与产奶量呈正相关能够反映出牧场综合管理得当。牧场在提高产奶量的同时也要稳定体细胞数以及乳脂率等相关指标。可见，加强牧场的日常管理，监控奶牛健康管理基础指标，及早发现并消除影响奶牛生产安全的隐患，增强奶牛自身的免疫力，使奶牛拥有健康的体魄是稳定体细胞数、乳脂率、乳脂产量、产奶量等DHI指标的重要手段。