基于非靶向代谢组学分析黄芪多糖对热应激奶牛血清代谢的影响

曾涵芳，林 红，裴明财，韩兆玉 (南京农业大学 动物科技学院 乳牛科学研究所，江苏 南京 210095)

奶牛热应激是指奶牛受到超过本身体温调节能力的高温刺激时，作用于下丘脑-垂体-肾上腺系统所引起的机体非特异性防御反应[1]。热应激改变奶牛的各种生理生化指标，降低奶牛的采食量、生产性能、免疫力和繁殖性能，严重制约奶牛生产相关行业的发展和经济效益[2]。目前，大部分研究都以营养调控手段来缓解奶牛热应激反应，然而，奶牛因其特殊的瘤胃代谢途径，一方面，这些调控因子进入机体后的具体代谢途径尚不明确；另一方面，其如何参与调节奶牛热应激反应的分子机制也所知甚少。因此，研究热应激奶牛分子调控机制，对于合理配置饲料资源，促进奶牛行业的健康可持续发展具有重要的理论和实践意义。

中草药因其含有多种生物活性物质而对生物机体产生有益影响。黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides,APS)是中药黄芪中主要活性成分，研究表明其在缓解畜禽热应激，提高生长性能中起到重要作用[3]。本课题组前期研究表明，APS对热应激奶牛生理状况和血清生化指标产生一定的影响，具有缓解奶牛热应激的潜力[4]，但其具体分子代谢机制值得探究。代谢组学通过研究机体内源代谢差异物及机体内源代谢物与机体代谢之间的关系，能更好地反映机体生理健康情况。因此，本试验旨在通过分析APS处理下热应激奶牛血清非靶向代谢组学，探究APS对奶牛热应激下的血清分子代谢机制，为APS的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理试验于2018年7月至2018年8月在江苏省某奶牛场进行。选取6头健康的荷斯坦奶牛(表1)，泌乳期日粮营养水平参照试验牛场饲养标准。试验期间奶牛颈部肌肉注射APS注射液(30 mL/d)，试验方法及饲养管理参考前期研究[4]。

表1 试验牛资料

1.2 试验牛舍环境温湿指数(THI)测定试验期间每天利用温度计和温湿表分别测定牛舍的温度和相对湿度，并利用公式THI=(1.8×T+32)-(0.55-0.55×RH)×(1.8×T-26)计算。

1.3 试验牛直肠温度和呼吸频率的测定在试验期间分别用兽用体温计和秒表测定试验奶牛的直肠温度和呼吸频率。

1.4 样品的采集与处理在试验0,21 d分别尾静脉采血10 mL，分离血清，-80℃保存待测。根据气相色谱-质谱代谢组学方法样本处理要求，对血清进行上机前预处理。质控样本QC为所有奶牛血清样本等体积混合物。

1.5 代谢组学分析分析仪器为安捷伦公司(Agilent Technologies Inc.CA,UAS)7890B-5977A GC/MSD气质联用仪，分析条件按照说明书进行设置。将GC-MS的原始数据(D格式)经Analysis Base File Converter软件转换为分析基本文件abf格式以便快速检索数据，导入MS-DIAL软件进行预处理，代谢物定性基于Fiehn数据库，最终导出原始数据矩阵。数据矩阵进行log2的数值转换后，使用无监督的主成分分析(PCA)及有监督的(正交)偏最小二乘法分析(OPLS-DA)进行分析。再根据OPLS-DA模型的一般变量权重值(variable important in projection,VIP)> 1，t检验P<0.05筛选组间差异代谢物。然后计算差异代谢物在两组中的FC值(fold change)，即变化倍数；经log2转化后，其值大于0表示上调，小于0表示下调。

2 结果

2.1 试验牛舍的环境THI试验期间牛棚的环境THI在82～88之间变化[5]，因此，该试验条件下奶牛处于中度热应激状态(图1)。

2.2 奶牛直肠温度和呼吸频率一般情况下，健康奶牛直肠温度为38.5℃，安静时呼吸频率为18～28次/min。本试验奶牛直肠温度高于38.5℃，呼吸频率大于35次/min。因此，在没有其他疾病的情况下，奶牛处于热应激状态(图2)。

2.3 奶牛血清样本谱图检查通过对试验前、后奶牛血清样本的总离子流色谱图(TIC)进行检查，所有样本的仪器分析均信号强、峰容量大且保留时间重现性好，说明仪器状况良好，数据模型可靠(图3)。

图1 试验牛舍环境温度、相对湿度及THI

图2 试验牛直肠温度和呼吸频率

A.试验前血清样本;B.试验后血清样本;C.质控;Q.试验前;H.试验后

2.4 多元统计分析对样本进行主成分分析(PCA)，PCA得分图中每一个点代表一个样本，两组样本呈分离趋势，没有重叠，因此，当前PCA模型能较为可靠地用于解释两组样本之间的代谢差异(图4A)。采用PLS-DA对试验前、后(HvsQ)两组样本进行分析，两组样本比较在PLS-DA得分图上分离，具有显著性差异(图4B)。由于模型R2Y和Q2(R2Y=0.998,Q2=0.884)都较高，因此，该模型对试验前、后两组间奶牛血清样本差异能很好地解释和预测。为获得更可靠的差异代谢物分析，过滤与模型分类不相关信号，采用OPLS-DA获得试验前、后两组样本OPLS-DA模型，并利用200次响应的RPT。如图4C所示，两组样本在OPLS-DA得分图上分离，说明具有显著的差异。

2.5 奶牛血清差异代谢物的筛选及鉴定奶牛血清组间差异代谢物是结合多维分析和单维分析来进行筛选，共鉴定27种差异代谢物。如图5A所示为试验前、后奶牛血清差异代谢物代谢情况，其中有19种差异代谢物上调，8种差异代谢物下调。为了更直观清晰了解奶牛血清27种差异代谢物的变化，对其峰面积进行聚类分析，其相对表达量如图5B所示。图中横行表示各组样本，竖列表示差异代谢物，红色表示差异代谢物表达上调，蓝色表示差异代谢物表达下调，颜色越深代表其差异越明显。

A.PCA得分图;B.PLS-DA得分图;C.OPLS-DA得分图;D.排序检验图;Q.试验前;H.试验后

选择与奶牛热应激相关的9种具有生物标志性的差异代谢物对其峰面积进行统计，其相对表达量如图6所示，其中，2-酮丁酸、甘氨酸、乳酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸上调，3-氨基异丁酸、果糖下调。因此，注射APS后对奶牛血清代谢产生影响。

A.奶牛血清差异代谢物火山图；B.奶牛血清差异代谢物热图。红色代表差异代谢物显著上调(P<0.05);蓝色代表差异代谢物显著下调(P<0.05);灰色代表没有显著差异(P>0.05)

*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001

2.6 奶牛血清差异代谢物代谢途径分析获取27种生物标志物KEGG ID，利用MBROLE通路分析功能，对奶牛血清潜在生物学标志物进行KEGG通路富集分析。如图7所示，根据代谢通路中P<0.05，以代谢通路名称为横坐标，以-log(P值)为纵坐标绘制代谢通路富集图。表2所示为差异代谢物代谢通路归属。本试验结果表明，注射APS对奶牛血清中氨基酸代谢、糖代谢、蛋白质代谢等代谢通路产生影响，其中变化显著的包括ABC转运器、赖氨酸降解、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、初级胆汁酸生物合成、嘧啶代谢、新陈代谢途径等。因此，APS主要通过影响奶牛机体氨基酸代谢过程来发挥其对热应激奶牛的作用。

红线.P=0.01;蓝线.P=0.05;条柱的顶端高于蓝线或红线时，其所代表的信号通路具有显著性

3 讨论

代谢组学的优势在于能够全面分析机体内源性代谢物的变化情况。研究表明，奶牛热应激可能与糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢等多种代谢途径有关[6-7]。本试验采用基于GC-MS的代谢组学方法，检测注射APS前、后热应激下奶牛血清变化，对其代谢产物进行比较，旨在发现潜在的缓解奶牛应激的生物标志物及代谢相关通路。通过GC-MS方法，本试验在奶牛血清中共鉴定27种差异代谢物，具有统计学意义。本试验选择与热应激相关的9种生物标志物，其中，2-酮丁酸、甘氨酸、乳酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸上调，3-氨基异丁酸、果糖下调。这些生物标志物主要参与奶牛氨基酸代谢等途径对热应激奶牛发挥作用。

表2 差异代谢物代谢通路归属

2-酮丁酸，又名α-酮丁酸，是胱硫醚裂解之后生成的产物，胱硫醚经胱硫醚γ裂解酶脱氨水解成半胱氨酸、α-酮丁酸及氨，其中，半胱氨酸是谷胱甘肽重要组成部分。谷胱甘肽是由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸结合的含有巯基的三肽，具有保护细胞、抗氧化、抗衰老、解毒等作用，是反映机体组织抗氧化能力的重要指标[8]。谷胱甘肽作为机体内某些酶的辅基或是辅酶，参与体内三羧酸循环及糖代谢，并能激活多种酶，从而促进三大营养物质的代谢[9]。本试验结果显示奶牛注射APS前后血清2-酮丁酸、甘氨酸以及谷胱甘肽代谢途径显著上调。由此可知，2-酮丁酸和甘氨酸可成为APS提高奶牛抗氧化功能，缓解奶牛热应激反应的潜在标志物。

β-氨基异丁酸，又名DL-3-氨基异丁酸，运动期间在骨骼肌中产生[10]。研究表明，β-氨基异丁酸对肥胖相关的代谢紊乱[11]、糖尿病[12]等具有益处，也有研究证实β-氨基异丁酸通过AMPK介导的途径减弱脂肪细胞中LPS诱导的炎症反应[13]。由于热应激不仅会引起奶牛能量代谢紊乱，还会导致其自由基失衡，从而引发奶牛氧化应激、炎症反应等，本试验APS奶牛血清3-氨基异丁酸含量下降，这可能为热应激导致奶牛氧化应激和炎症反应的主要因素。

果糖是一种最为常见的己酮糖，存在于水果、蜂蜜中，也是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体。70%的果糖在肝脏内进行代谢，剩余部分主要在肾脏、肌肉和脂肪等组织内代谢。与葡萄糖的代谢不同的是果糖主要通过1-磷酸果糖途径代谢，可合成肝糖原[14]。随着果糖在人们饮食中占比的增加，学者们已研究发现果糖摄入增加可导致肥胖[15]、高血压[16]和心血管疾病[17]。研究表明，过量的果糖会引发脂肪肝[18]。此外，果糖的最终代谢产物尿酸通过激活转化生长因子β-1和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸促进活性氧(ROS)的生成[19]，因此，果糖可通过多种途径升高氧化应激水平，降低组织的抗氧化能力。APS本身为一种多糖复合物，本试验结果显示热应激奶牛注射APS后血清果糖显著下降，这可能是由于APS提高了热应激奶牛机体ROS的清除能力，从而加快了奶牛机体果糖的代谢循环。

反刍动物的能量代谢不同于其他动物，主要靠瘤胃微生物发酵产生的挥发性脂肪酸供能。葡萄糖是动物代谢活动的最基础营养素，通常葡萄糖的来源有两个途径：一是从胃肠道吸收；二是体内生糖物质(乳酸、甘油、生糖氨基酸、丙酮酸、丙酸等)转化。三羧酸循环是糖、脂、蛋白质，甚至核酸代谢的联络与转化的枢纽，糖有氧氧化过程中产生的α-酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸等与氨结合可转变成相应的氨基酸；而这些氨基酸脱去氨基又可转变成相应的酮酸而进入糖的有氧氧化途径。同时脂类物质分解代谢产生的甘油、脂肪酸代谢产生的乙酰CoA也可进入糖的有氧氧化途径进行代谢[20]。热应激阶段奶牛伴随能量摄入的减少及消耗的增加，与能量负平衡相关代谢紊乱的生理机制研究显得尤为重要。能量负平衡会引起多条代谢通路发生变化以维持泌乳所需的生理条件[21]。热应激可以降低葡萄糖、胰岛素和非酯化脂肪酸的浓度[22]。甘氨酸为生糖氨基酸，色氨酸和酪氨酸为生糖兼生酮氨基酸。苯丙氨酸作为机体的必需氨基酸之一，在体内可催化生成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢[23]。本试验中乳糖、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸均显示上调；此外，多种氨基酸代谢途径发生显著变化，如赖氨酸降解，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氨酰基-tRNA的生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，β-丙氨酸代谢等，因此，APS可能通过调节奶牛糖异生/糖酵解、氨基酸代谢来缓解热应激带来的生理影响。

综上所述，基于GC-MS非靶向血清代谢组学，APS可通过影响热应激奶牛血清糖代谢、氨基酸代谢途径调节奶牛的血清代谢平衡，且对热应激奶牛血清谷胱甘肽代谢途径产生积极影响，因此具有缓解奶牛热应激的潜力。