“Bolgogragsky”番茄cDNA文库的构建及质量评价

张佳蕊 郝娟 张喜春

摘要 MYB102 转录因子在番茄响应低温胁迫中起着重要作用，为了进一步探究番茄转录因子MYB102的分子作用机理，筛选其蛋白，以“Bolgogragsky”为材料，从番茄的根、茎、叶、花、果以及萼片组织中提取总RNA，以其为模板合成双链cDNA，纯化后与载体pGADT7-Rec共转化入酵母Y187感受态细胞中构建酵母双杂交cDNA文库。经测定，文庫容量为2.31×107 CFU，cDNA文库的转化效率为7.02×106 CFU/μg，文库滴度为2.5×108 CFU/mL，重组率为97%，插入的cDNA片段长度主要分布在250～2 000 bp。结果表明，构建的番茄cDNA文库符合酵母双杂交文库要求，可用于筛选MYB102的互作蛋白。

关键词 番茄;酵母双杂交;cDNA文库;SMART技术

中图分类号 S 641.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）03-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.024

The Construction and Quality Evaluation of “Bolgogragsky” Tomato cDNA Library

ZHANG Jia-rui， HAO Juan， ZHANG Xi-chun

（College of Plant Science and Technology， Beijing Agricultural University， Beijing 102206）

Abstract MYB102 transcription factor plays an important role in tomato response to low temperature stress. In order to further explore the molecular mechanism of tomato transcription factor MYB102 and screen the protein interacting with it， a tomato yeast two-hybrid cDNA library was constructed in yeast Y187 by SMART technology. The Russian tomato variety Bolgogragsky was used to construct the yeast two-hybrid cDNA library. The total RNA was extracted from tomato root， stem， leaf， flower， fruit and sepal tissue， and was used as template to synthesize double stranded cDNA. After purification， it was transformed into yeast Y187 receptive cells together with vector pGADT7-Rec to construct yeast two-hybrid cDNA library. The test showed that the library capacity was 2.31×107 CFU， the cDNA library conversion efficiency was 7.02×106 CFU/μg， and the library titer was 2.5×108 CFU/mL. The recombination rate was 97%， and the length of the inserted double stranded cDNA fragments was mainly distributed in 250-2 000 bp. The results showed that the constructed tomato cDNA library met the requirements of yeast two-hybrid library and could be used to screen MYB102 interaction proteins.

Key words Tomato;Yeast two-hybrid;cDNA library;SMART technology

基金项目 科技合作项目“中俄主要蔬菜基因资源多样化比较研究”（2011DFR31180-3）。

作者简介 张佳蕊（1996—），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向：蔬菜生物技术与遗传育种。郝娟（1994—），女，山西临汾人，硕士研究生，研究方向：蔬菜生物技术与遗传育种。张佳蕊和郝娟为共同第一作者。 通信作者，教授，从事蔬菜生物技术与遗传育种研究。

收稿日期 2021-09-27

番茄（Solanum lycopersicum L.）是茄科番茄属的喜温性蔬菜，在我国南北方广泛种植[1]，因其营养丰富，深受各地人们喜爱。低温是制约植物生长发育和产量的重要逆境因子，低温胁迫会发生在番茄生长的各个时期，对番茄种子萌发、苗期叶片和根系发育、花芽发育及开花坐果等方面均有影响[2]。因此，关于番茄抗寒方面的研究一直备受关注。

MYB转录因子是一类具有高保守DNA结合结构域的蛋白，通过与基因启动子区域特异性结合来激活基因表达[3]，其功能多样，广泛参与植物生长发育及胁迫应答过程[4]。MYB102是一个R2R3-MYB型转录因子，有研究表明番茄MYB102转录因子参与低温胁迫的响应和调节，瞬时沉默MYB102基因，沉默组番茄耐寒性与对照组相比明显降低[5]。但MYB102转录因子如何实现调控，其具体的作用机制尚不清楚。

酵母双杂交系统由Fields和Song建立，是目前常用的蛋白互作研究方法[6]，可以检验已知蛋白间的相互作用，也可用于发现新蛋白或蛋白新功能[7]。目前，这种方法已应用于多种作物的质量性状及病害领域研究。赵光耀[8]构建小麦全长cDNA文库，谢卡斌[9]构建水稻全长cDNA文库，赵怀印等[10]构建成熟期的番茄果实cDNA文库，韦淑亚[11]构建油菜菌核病相關cDNA文库等。为了筛选出与MYB102互作的蛋白，进而探究该转录因子的调控机制，笔者以俄罗斯番茄品种“Bolgogragsky”番茄根、茎、叶、花、果等不同组织为材料，采用SMART技术构建番茄酵母双杂交cDNA文库。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄品种为实验室自存俄罗斯番茄品种“Bolgogragsky”（编号为25），来自北京农学院蔬菜育种与生物技术实验室。酵母Y187感受态细胞，酵母cDNA文库构建试剂盒（Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System）和SD-Leu培养基购自Clontech公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养及取样。

“Bolgogragsky”番茄种子置于湿润滤纸上25 ℃暗培养催芽，发芽种子播种到穴盘并于20～25 ℃（16/8 h，day/night，湿度60%）条件下培养，待幼苗长至四叶一心时定植到日光温室自然低温生长。开花期取番茄植株的根、茎、叶、花、萼片等组织样品，果实成熟期取成熟果实、果肉，分别用锡箔纸包好，置于液氮中速冻，然后于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 番茄总RNA的提取。

用Trizol法提取番茄各组织的总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计检测总RNA浓度与质量，以确保初始RNA质量满足建库的要求。各组织提取的总RNA按浓度稀释成1 000 ng/μL，将稀释好的各组织RNA各取1 μL混匀，组成混合总RNA。

1.2.3 双链cDNA的合成与纯化。

参考Make Your Own “Mate & Plate TM” Library System User Manual说明书，引用姜赟等[12]的试验方法，稍作改动。按说明书操作向2 μL混合后的总RNA中加入以下试剂：①CDS Ⅲ Primer 1 μL;②去离子水1 μL，72 ℃ 2 min，冰上冷却2 min，14 000 g瞬时离心10 s。然后依次加入：①5×First-Strand Buffer 2 μL;②DTT 1 μL;③dNTP Mix 1 μL;④SMART MMLV Reverse Transcriptase 1 μL，瞬时离心，42 ℃下温浴10 min后加入SMART Ⅲ-modified oligo 1 μL，42 ℃ 1 h，75 ℃ 10 min。待冷却至室温，加入RNaseH 1 μL，37 ℃温浴20 min，得到合成的第1链cDNA 产物。

通过LD-PCR进行第2链cDNA合成，PCR体系100 μL，依次加入去离子水、单链cDNA、10×Advantage 2 PCR Buffer、50×dNTP Mix、5′和3′PCR引物、10×Melting Solution、50×Advantage 2 PolymeraseMix。扩增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min，20个循环，68 ℃ 5 min，得到产物为双链cDNA。

双链cDNA的纯化，按照CHROMA SPINTM+TE-400说明书进行操作。纯化后用1%琼脂糖凝胶电泳检测双链纯化结果。

1.2.4 番茄酵母双杂cDNA文库构建及质量评价。

将纯化的双链cDNA转入酵母菌株Y187感受态细胞，引用姜赟等[12]的试验方法，略作改动。

参考 Make Your Own “Mate & Plate TM” Library System User Manual说明书用冻存液收集保存酵母文库菌液。将转化液涂于150 mm SD-Leu平板上，30 ℃倒置培养3～5 d，待大部分长出菌斑后，置于4 ℃冰箱中预冷4 h，每个平板加入5 mL冻存液，用无菌枪头刮取所有菌落，收集于无菌三角瓶，混匀，无菌1.5 mL离心管分装，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

取100 μL酵母菌转化液分别按1/10、1/100、1/1 000、1/10 000稀释，分别取100 μL稀释液涂布SD-Leu平板，30 ℃倒置培养3～5 d，统计酵母菌落数，计算文库容量和文库转化效率。计算公式：文库容量（CFU）=单菌落数量×溶液总体积×稀释倍数/涂板体积;文库转化效率（CFU/μg）=单菌落数量×溶液总体积×稀释倍数/涂板体积×DNA 总质量（μg）。取50 μL冻存液收集的酵母文库菌液，按上述比例稀释，分别涂布SD-Leu平板，30 ℃条件下培养至长出菌落，统计酵母菌落数，计算cDNA文库滴度，文库滴度（CFU/mL）=单克隆数量×稀释倍数/涂板体积（mL）。随机挑取平板上的单菌落，进行菌落PCR扩增及1%琼脂糖凝胶电泳，检测cDNA文库插入片段长度与重组率，重组率=重组片段PCR的条带数/挑取单菌落数×100%。

2 结果与分析

2.1 番茄不同组织总RNA的提取

提取的番茄各组织总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，可清晰观察到28、18和5 s 3条条带，且28 s条带亮度最高，18 s条带亮度次之，说明提取的RNA完整性较好（图1），个别条带出现弥散现象，可能原因是RNA有少量降解。

检测RNA纯度和浓度，结果显示，花和叶片组织中RNA浓度较高，茎、萼片和果次之，根组织中RNA浓度最低，各组织RNA吸光度值OD260/OD280在1.88～2.00，表明RNA质量良好，可用于后续试验（表1）。

2.2 双链cDNA的合成与纯化

将各组织RNA等量混匀，以2 μL混合后的总RNA为模板合成双链cDNA，纯化后得到5.08 μg ds cDNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的双链DNA，结果可见条带呈弥散状分布，分布范围在250 bp以上，纯化后250 bp以下片段基本去除（图2）。

2.3 番茄cDNA文库的构建及质量评价

纯化后的ds cDNA与pGADT-Rec载体重组后共转入Y187酵母感受态细胞中。在100个缺少亮氨酸的培养基（SD-Leu）中培养，约5 d长出菌落（图3A）。用冻存液收集cDNA 文库酵母菌落，获得约450 mL菌悬液，分装后保存于-80 ℃冰箱备用。

取100 μL转化液稀释100倍，涂50 μL稀释后的转化液至100 mm SD-Leu平板，30 ℃条件下培养，计算得该文库容量为 2.31×107 CFU，文库转化效率7.02×106 CFU/μg（图3B）。在SD-Leu平板中培养并收集cDNA文库转化液，取冻存液收集的酵母文库菌液50 μL稀释10 000倍，在SD-Leu平板上涂布并培养4 d，长出1 438个单菌落（图3C），按公式计算文库滴度为2.5×108 CFU/mL。

随机挑取36个平板上的单菌落，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，出现35个明显条带，根据公式计算，重组率为97%，插入的片段主要分布在250～2 000 bp（图4）。综上所述，该酵母双杂交cDNA文库满足建库要求，可用于后续试验。

3 讨论

酵母双杂交是研究基因功能及探究验证互作蛋白的常用方法。构建酵母双杂交cDNA文库的方法有很多，常见方法主要有Gateway技术、SMART技术等。李颖波等[13-14]采用Gateway技术分别构建了大麦和葡萄叶片cDNA文库，用于筛选盐胁迫下和霜霉菌侵染下的互作蛋白。SMART技术具有操作步骤简单，起始RNA用量少的优点，只需要微量总RNA即可得到高质量cDNA库，无需额外抽提或酶反应，在构建金柑花蕾[15]、花生[16]、不结球白菜[17]、芝麻[18]等植物酵母双杂交cDNA文库时被广泛应用。因此，该试验以番茄不同组织为样本，提取总RNA后用SMART技术合成全长cDNA构建文库。

构建具有高质量的酵母双杂交cDNA文库为后续筛选互作蛋白奠定基础[19]。通常从两个方面来评价构建的cDNA文库质量[20]：①用文库容量来衡量cDNA文库的代表性，文库滴度高于1×106 CFU/mL时满足要求;②用插入片段大小和重组率描述重组序列完整性[11]。在该试验中，文库容量为2.31×107 CFU，文库滴度为2.5×108 CFU/mL，表明文库中cDNA的种类丰富，具有较高的完整性，满足建库标准。文库插入片段大小200～2 000 bp，重组率为97%，证明cDNA序列较完整，可用于下一步筛选与转录因子MYB102相互作用的蛋白。

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