反相高效液相色谱测定硫酸羟氯喹原料有关物质的方法学研究

2022-03-03黄梦芹

上海化工 2022年1期

黄梦芹

上海上药中西制药有限公司（上海 201806）

硫酸羟氯喹即（±）-2[[4-[（7-氯-4-喹啉基）氨基]苯基]-乙氨基]乙醇硫酸盐（C18H26ClN3O·H2SO4），其化学结构式如图1所示。

图1 硫酸羟氯喹的化学结构

硫酸羟氯喹是喹酮类抗疟药，通常被作为抗风湿病的独特药物。其由芳香环构成，结构中氯喹的乙基被羟乙基所代替。该药物于1944年人工合成，1950年以来，随着抗疟药在系统性红斑狼疮及风湿性关节炎治疗中的广泛应用[1]，硫酸羟氯喹被广泛应用于临床治疗风湿病；学者研究表明，该药物还可用于治疗原发性干燥综合征（PSS）、痛风关节炎、皮肌炎等[2-4]。至20世纪后期，在临床上，用硫酸羟氯喹来治疗类风湿病已超过90%[5]。

美国药典（USP）、我国药典标准及部颁标准ChP均采用薄层色谱法（TLC）来检测硫酸羟氯喹中的相关物质，但该方法特异性不强、灵敏度偏低，且只能进行有关物质限度检查，不能测定出杂质含量。英国药典（BP）虽采用高效液相色谱（HPLC）测定，但样品前处理步骤比较复杂[6]。文献[7]表明，通过HPLC法对硫酸羟氯喹有关物质项的方法学进行质量研究，样品前处理步骤比较简便，方法简单快速且专属性好，色谱条件简单。

为了进一步控制上海上药中西制药有限公司硫酸羟氯喹原料的质量，全面探究了硫酸羟氯喹有关物质2种杂质的测定，并使用C18柱，建立了测定硫酸羟氯喹原料中有关物质的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，根据主成分自身对照法测定了2种已知杂质含量。

1 实验部分

1.1 仪器

AL104电子天平、XPE105电子天平、S210 pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 试剂

乙酸铵、硫酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，国药集团沃凯试剂有限公司；乙腈，色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；四氢呋喃，色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司。

1.3 标准品

实验过程使用的标准品如表1所示。

表1 标准品信息

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18柱（4.6 mm×150 mm×5μm）；以0.05 mol/L乙酸铵水溶液（用三乙胺溶液调pH=10.5）为流动相A，以甲醇-乙腈-异丙醇（体积比为70∶20∶10）为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序如表2所示；柱温箱温度为35℃；洗脱流速为0.8 mL/min；紫外检测波长为254 nm。

表2 梯度洗脱程序

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 系统适用性溶液制备

取硫酸羟氯喹原料以及杂质E，杂质F对照品适量，配制成1 mL中含硫酸羟氯喹0.5 mg，杂质E及杂质F各0.5μg的混合溶液，作为分离度溶液。

1.4.2.2 硫酸羟氯喹一级贮备液制备

精密称定硫酸羟氯喹标准品25 mg置于50 mL容量瓶中，加稀释剂适量使其溶解，再定容，混匀。

1.4.2.3 灵敏度溶液制备

精密量取硫酸羟氯喹一级贮备液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀；再精密量取上述溶液1.0 mL置于250 mL容量瓶中，用稀释液稀释定容，摇匀。

1.4.2.4 杂质对照品溶液的制备

分别称取约10 mg的杂质E，杂质F置于100 mL容量瓶中，用稀释剂溶解稀释至100 mL，作为各杂质贮备液1。移取杂质E，F贮备液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀，作为准确度杂质对照品溶液。

1.4.2.5 硫酸羟氯喹供试品母液制备

称取硫酸羟氯喹供试品1.0 g置于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。

1.4.2.6 供试品溶液制备

移取硫酸羟氯喹供试品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分别加入适量的准确度杂质对照品溶液，稀释至刻度，混匀，作为供试液。

1.4.2.7 对照溶液制备

精密量取供试品溶液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，用稀释溶液稀释至刻度；移取该溶液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀释溶液稀释至刻度。

1.4.2.8 测定方法

精密量取系统适用性溶液、灵敏度溶液、空白溶液、杂质E和杂质F贮备液10μL，注入液相色谱仪，系统适用性溶液中各组分的分离度不得小于1.5，灵敏度溶液峰信噪比不小于3；精密量取供试液及其稀释的对照溶液10μL，记录色谱图，用自身对照法来计算供试液中杂质E，杂质F的含量。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

精密量取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，结果如表3所示。在有关物质色谱条件下，理论塔板数按硫酸羟氯喹计为40131，各峰之间分离度均大于1.5，说明该法色谱条件分离效果好。

表3 有关物质系统适用性试验结果

2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）试验

精密量取5.0 mL杂质E，杂质F杂质对照品溶液，置于50 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为各线性混合液的杂质贮备液。再用稀释剂稀释成不同质量浓度的溶液，精密量取10μL，以信噪比（S/N）大于10为定量限；取定量限溶液稀释3倍（3→10），作为检测限。

在该色谱条件下，杂质E，杂质F和硫酸羟氯喹的定量限分别为0.0546，0.050 6和0.0509 mg/L；杂质E，杂质F检测限分别为0.018 2和0.016 9 mg/L。各杂质的检测限均在供试品质量浓度的0.01%以下，说明该色谱法灵敏度较高。

2.3 专属性试验

精密量取空白溶液10μL，注入液相色谱仪，空白稀释剂溶液色谱图在硫酸羟氯喹、杂质E和杂质F保留时间处无干扰峰。

2.4 线性试验

精密称取硫酸羟氯喹、杂质E和杂质F对照品适量，分别用水-甲醇-10%硫酸（体积比为125∶125∶1）溶液稀释制成不同质量浓度的溶液，在有关物质项的色谱条件下，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，按照上述步骤进行线性回归计算，结果如表4所示。

表4 硫酸羟氯喹及各杂质线性试验结果

由表4可知，杂质E在0.053 5～1.070 9 mg/L（相当于供试品质量浓度的0.01%～0.20%）内，线性关系良好；硫酸羟氯喹在0.051 6～1.032 8 mg/L（相当于供试品质量浓度的0.01%～0.20%）内，线性关系良好；杂质E在0.051 8～1.036 6 mg/L（相当于供试品溶液质量浓度的0.01%～0.20%）内，线性关系良好。

2.5 准确度试验

移取硫酸羟氯喹供试品母液5.0 mL置于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，作为空白溶液。移取杂质E，F贮备液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，作为准确度杂质对照品溶液。移取硫酸羟氯喹供试品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分别加入适量准确度杂质对照品溶液，各制成每1 mL分别含杂质0.25，0.5和0.6μg的混合溶液。每个质量浓度平行配制3份供试液，进行准确度试验，结果表明：杂质E的平均回收率为102.04%，相对标准偏差（RSD）为5.0%；杂质F的平均回收率为94.98%，RSD为4.5%。该方法测得的硫酸羟氯喹杂质E和杂质F中，9份样品平均回收率均在94.63%～105.10%间，RSD均符合限度，证实该方法的准确度较高，也证明了其精确性和可靠性。

2.6 精密度试验

2.6.1 重复性试验

供试品溶液制备同1 mL含杂质0.5μg的准确度溶液制备，平行配制6份供试液，检测有关物质。结果表明，在6份供试液中：杂质E含量的RSD为1.8%，均值为0.10%；杂质F含量的RSD为2.2%，均值为0.10%；相对保留时间（RRT）为0.44的杂质含量的RSD为1.6%，均值为0.06%；RRT为0.50的杂质含量的RSD为2.8%，均值为0.03%；RRT为0.67的杂质含量的RSD为7.2%，均值为0.01%；RRT为1.24的杂质含量的RSD为1.8%，均值为0.03%；RRT为0.20的杂质含量的RSD为9.0%，均值为0.01%。在6份供试品溶液中，总杂质含量RSD为2.2%，绝对差值为0.02%，表明该方法重复性好。

2.6.2 中间精密度

由不同检验员在不同日期使用不同仪器（更换色谱柱批号），按重复性步骤进行操作。12份供试液中：杂质E含量的RSD为7.6%，均值为0.11%；杂质F含量的RSD为7.0%，均值为0.10%。12份供试品溶液总杂质含量的绝对差值为0.05%，总杂含量的RSD为3.1%，表明该方法的精密度较好。

2.7 稳定性试验

供试品溶液制备同1 mL含杂质0.5μg的准确度溶液制备。取一份系统适用性溶液，一份供试液，在室温下保存，分别于0，5，10，28，40，48，56及64 h取样，取上述2种溶液各进样1针，考察供试液稳定性。结果表明，供试液在室温条件放置64 h之内，各时间段杂质含量与刚配制好（0 h）时含量的绝对差值范围为0～0.01%，总杂质含量的绝对差值均为0.02%。由此可知，供试品溶液在64 h内稳定。

2.8 耐用性试验

供试品溶液制备同1 mL含杂质0.5μg的准确度溶液制备。改变流速、柱温以及流动相pH，进行耐用性挑战试验（不同序列号色谱柱在中间精密度中考察，接受标准为中间精密度标准），结果如表5所示。由表5可知，进样流速、柱温、流动相pH及色谱柱批号等在一定范围内变动均不影响主成分的测定，证实该方法的耐用性好。