大豆孢囊线虫侵染绿豆的国内首次报道
2022-03-03耿晶晶杨艺萌尹添赵增旗徐玉梅
耿晶晶,杨艺萌,尹添,赵增旗,2,徐玉梅*
(1.山西农业大学 植物保护学院,山西 太谷 030801;2.新西兰皇家研究院 土地环境研究所,新西兰 奥克兰 1142)
绿豆(Vigna radiata)隶属于豆科,是我国重要的杂粮作物。中国是绿豆的原产国,主要种植区在黄淮河流域和东北,包括内蒙古、吉林、山西、河南和安徽等地[1]。2019 年我国绿豆产量为57.30 万t,占全球总产量的2.1%,居世界前列[2]。
孢囊线虫(Cyst nematodes)指在根际部形成的孢囊状线虫,主要包括孢囊属(Heterodera)、球形孢囊属(Globodera)和仙人掌孢囊属(Cactodera),其中具有重要经济价值的种类有大豆孢囊线虫(H.glycines)、小麦孢囊线虫(H.avenae和H.filipjevi)、甜菜孢囊线虫(H.schachtii)以及马铃薯孢囊线虫(G.rostochiensis和G.pallida)等,孢囊线虫可引起植物病害,带来严重的经济损失[3-6]。Epps 等[7]首次在室内接种证明绿豆是大豆孢囊线虫的新寄主,后相继在绿豆上报道的孢囊线虫有木豆孢囊线虫(H.cajani)[8-9]和野生豆孢囊线虫(H.sojae)[10]。
本研究为明确山西省晋中东阳县绿豆上孢囊线虫的病原种类,采用传统形态学和分子生物学结合的方法,对其进行种类鉴定和致病性测定,为进一步制定相应防控对策提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 线虫的采集、分离和标本制作
1.1.1 采集
2020 年6 月在山西省晋中市东阳县(37°32′15′′N,112°40′02′′E,802 m)绿豆育种田中采集发病植株及其根际土壤样本,记录采集相关信息,带回实验室冷藏保存备用。
1.1.2 分离
根际孢囊采用直接挑取法分离,土壤中孢囊采用漂浮法分离[11]。分离的孢囊一部分用于孵化二龄幼虫,另一部分用于致病性测定。
1.1.3 标本制作
将二龄幼虫用4%福尔马林热杀死固定[12],然后用Seinhorst 法进行脱水[13],蜡圈法制成永久玻片以备形态测量。参照段玉玺[11]的方法制作阴门锥并观察测量。
1.2 孢囊线虫的形态学观察
1.2.1 光学显微镜的形态观察和测量
将上述制作好的永久玻片置于尼康显微镜下进行观察,用软件NIS Elements version 4.10 进行测量和拍照,记录相关测量数据,并计算a、b、c 和c′等de Man 数值。
1.2.2 扫描电镜样品的制备及观察
挑取完整孢囊和二龄幼虫放入2.5%戊二醛溶液中固定14 d,用灭菌dd H2O 清洗3 次,依次用30%、70%、80%、90%、95% 乙 醇 洗 脱10 min,100%乙醇处理2 次,每次15~20 min,用叔丁醇置换无水乙醇2 次,每次10 min,将干燥后的线虫样本置于冷冻干燥机(JEOL JFD-320)中过夜,随后进行粘样,喷金镀膜。将制作好的样品置于扫描电镜(JEOL JSM-6490LV)下观察并拍照。
1.3 分子序列分析
1.3.1 DNA 的提取
采用蛋白酶K 法进行DNA 提取[14-15]。
1.3.2 PCR 的扩增
采用通用引物对孢囊线虫的28S、ITS 和COI基 因 进 行PCR 扩 增。28S 引 物:D2A(5’-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3’)和D3B(5’-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3’)[16]。ITS 引物:TW81(5’-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3’)和AB28(5’-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT-3’)[17]。COI 引物:JB3(5’-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT TAT-3’)和JB4.5(5’-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3’)[18]。扩增程序为:95 ℃2 min,95 ℃10 s,53 ℃30 s,72 ℃60 s,40 次循环,72 ℃7 min,用1%的核酸凝胶电泳检测。将PCR 扩增产物直接送至生工生物公司(上海)股份有限公司进行测序。
1.3.3 系统发育树的构建
将测序结果用Sequencher 5.2.2 整理编辑,从NCBI 下载孢囊属Heterodera类群,用Cryphodera brinkmani做外群,用Geneious Prime 2019[19]分别构建ITS+28S 联合基因系统发育树和COI 基因系统发育树,用FigTreeV 1.4.3 查看系统发育树。
1.4 致病性测定
1.4.1 绿豆植株准备
绿豆品种“并绿9 号”由山西农业大学农学院小杂粮研究中心提供。将绿豆种子用次氯酸钠溶液消毒后,播种在装有经高压灭菌(150 ℃,烘干1.5 h)的肥沃土壤与育苗基质1∶1 混合的花盆中,每盆播种3 株,共播种20 盆。
1.4.2 致病性的测定
待绿豆出苗后至两叶一心期进行间苗,每盆留有1 株。接种1.1.2 分离得到的孢囊,每盆接种12个孢囊,共接种10 盆,其余10 盆作为空白对照。采用常规管理,40 d 和46 d 后拔出绿豆植株观察是否有孢囊形成,并采用次氯酸钠-酸性品红染色观察孢囊线虫在根际部的分布[20]。
2 结果与分析
2.1 症状观察
孢囊线虫侵染绿豆的田间症状表现:植株发育不良,秧苗矮小,子叶和真叶变黄,逐渐干枯(图1A、图1B)。病株根部根系不发达,侧根减少,须根增多,根瘤减少(图1D),且根上有许多淡黄色小颗粒(图1C),即为孢囊线虫的雌虫(图1E)。在发病田绿豆根际土壤中采集的种群密度为每100 g 湿土70个孢囊。
图1 孢囊线虫侵染绿豆的田间症状Fig.1 Symptoms of mung bean infected by cyst nematodes in the field
2.2 形态学鉴定
2.2.1 特征描述
孢囊:柠檬形(图2A),初期白色,后期为褐色或黄褐色,长412~571 μm,宽223~284 μm。阴门锥明显(图2B),阴门膜孔为双半膜孔型(图2C),阴门裂35.9~48.7 μm,膜孔长39.7~42.4 μm,膜孔宽28.0~36.3 μm,下桥长89.2~97.8 μm(图2E),泡状突较多(图2D),排列不规则。
卵:长椭圆形,长97.4~103 μm,宽44.0~46.8 μm,卵壳透明光滑,内有折叠的一龄幼虫(图2F)。
二龄幼虫:虫体呈蠕虫形,体长401~456 μm。唇区缢缩(图2G),口针细长,长21.5~25.0 μm,口针基部球明显。中食道球圆形,长12.3~20.0 μm,宽8.9~11.9 μm。排泄孔明显,位于半月体后端,距离体前端88.4~108 μm。侧线4 条(图2I)。尾圆锥形,透明尾明显,长19.2~31.1 μm(图2H)。
图2 孢囊和二龄幼虫形态特征Fig.2 Micrographs of the cyst and J2 of cyst nematode
雄虫:未发现。
2.2.2 形态测计值
测量结果见表1。
2.3 分子生物学鉴定
测序结果表明,绿豆根际孢囊线虫的28S 的扩增 片 段 长 度 为 710 bp(GenBank 登 录 号OK012079),将其与GenBank 中已知序列进行对比,与大豆孢囊线虫(H.glycines)(KX017535)和苜蓿孢囊线虫(H.medicaginis)(MH793872)的序列相似度均为100%。ITS 区域序列(OK001855)长度 为934 bp,与 大 豆 孢 囊 线 虫(MT254745,MG845112,MG845079 和MG845051)的序列相似度达100%,与苜蓿孢囊线虫(AF274391)的序列相似率达99%。COI 基因扩增片段的长度为395 bp(GenBank 登录号OK001854),与大豆孢囊线虫(MT644158,MK188448 和KC172914)的序列相似度 为 99%,与 苜 蓿 孢 囊 线 虫(MK093162 和MK093166)的序列相似率为96%。
以布林克曼隐皮孢囊线虫(Cryphodera brink⁃mani)为外群,构建ITS+28S 联合系统发育树显示(图3),本试验种群与大豆孢囊线虫和苜蓿孢囊线虫位于同一分支上,置信度达100%;COI 系统发育树显示(图4),本试验种群与大豆孢囊线虫(MK093154,MK093153,KY775596,MN720172)位于同一个分支上,置信度达100%,而苜蓿孢囊线虫则单独位于另一分支上。
图3 基于大豆孢囊线虫ITS+28S 基因联合构建的系统发育树(置信度>50%注在相应的节点处)Fig.3 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from ITS and 28S rRNA gene sequences(posterior probability values exceed⁃ing 50% are given on appropriate clade)
图4 基于大豆孢囊线虫COI 基因构建的系统发育树(置信度>50%注在相应的节点处)Fig.4 Phylogenetic tree of Heterodera glycines inferred from COI rRNA gene sequences(posterior probability values exceeding 50% are giv⁃en on appropriate clades)
2.4 致病性测定
在接种40 d 后,在绿豆根部未观察到孢囊,对其根部染色后,观察到线形J2(图5A、图5B)和腊肠状的J3 虫态(图5B),以J2 居多。接种46 d 后,根部观察到少数孢囊(图5D),染色后根部可观察到J2、J3 和J4 虫 态,以J3 居 多,J2 较 少,仅 观 察 到1 个J4(图5C),此结果说明孢囊线虫回接到健康绿豆上可引起植株发病,形成孢囊(表2)。
图5 绿豆致病性测定的根部染色结果图Fig.5 The staining results of the mung bean roots inoculated with cyst nematodes
表2 健康绿豆接种大豆孢囊线虫后不同时期体内虫态及数量统计Table 2 The stage and number of cyst nematodes in the healthy mungbean after inoculation
3 讨论
大豆孢囊线虫是大豆生产上的毁灭性病害之一,在世界大豆产区普遍发生。在中国1899 年首次在东北地区发现,目前在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、河北、河南、山东、山西、陕西、安徽、北京、浙江、江苏等22 省大豆产区发生,发生面积200 多万hm2,以东北和黄淮海大豆产区发生最严重,每年造成高达1.2 亿美元的损失[10,21]。主要寄主有大豆、菜豆、红小豆、豌豆和食用豆等豆科植物[10,22]。
本试验种群的阴门锥与Mulvey[23]的报道一致。孢囊及二龄幼虫数据与Ichinohe[24]的原始描述基本吻 合,除 孢 囊 体 较 窄(223~284 μmvs350~670 μm)。此外,在分子序列特征上来看,大豆孢囊线虫和苜蓿孢囊线虫两者的ITS(99%)和28S(100%)序列均相近,用单独序列相似度和系统发育树无法将两者分开,本试验构建的ITS+28S 联合序列发育树也无法将两者区分。但是COI 系统发育树则可以很好地将两个序列相近种区分开来,本试验结果与Powers 等[25]结果一致。
Epps 等[7]首次在室内接种证明大豆孢囊线虫可侵染绿豆;李秀花等[26]采用田间盆栽的试验方法,将大豆孢囊线虫3 号生理小种接种到绿豆上,38 d 后在土壤中可观察到1 个孢囊;本论文首次报道了大豆孢囊线虫在田间侵染绿豆发病,致病性接种后可以侵染绿豆,并能完成其生活史形成孢囊。而甄浩洋等[27]采用人工接种野生豆孢囊线虫可侵染绿豆,但不能完成生活史。
种植抗病品种是孢囊线虫病最经济有效的防治措施,而大豆孢囊线虫生理小种的鉴定是抗性品种培育、鉴定、推广的前提和依据。目前大豆孢囊线虫多数生理小种已在全球报道,美国报道有13 个生理小种[28]。在我国也有生理小种的相关报道[29-30],现报道的生理小种有11 个,其中1 号、3 号和4 号在全国范围内面积最大、分布最广,3 号小种致病力最弱、4 号最强,3 号是东北地区的优势小种,而1 号和4 号是黄淮海地区的优势小种[31]。已有研究表明中国黄淮海和美国密苏里州大豆产区的优势小种均由1 号小种演变为致病性更强的2 号小种[32-35]。山西省是国内大豆孢囊线虫感染最严重的地区,优势小种是致病力较强的4 号和12 号小种[32,36]。本研究只对绿豆上的孢囊线虫进行了种类鉴定和致病性测定,具体的生理小种类型还有待于进一步鉴定。
4 结论
本试验运用形态学和分子生物学相结合,将绿豆病田中采集到的孢囊线虫种类鉴定为大豆孢囊线虫。将大豆孢囊线虫回接到健康绿豆上,40 d 后根部观察到J2 和J3,46 d 后观察到J4 和孢囊形成。首次在中国发现大豆孢囊线虫在田间侵染绿豆,在绿豆产区要及时监测,并采取轮作措施或杀线虫剂等进行合理防控。