基于Heracles Neo超快速气相电子鼻对广藿香饮片的快速鉴别及气味指纹图谱研究

朱广飞，王 静，钱怡洁，张科卫，陆兔林，毛春琴

基于Heracles Neo超快速气相电子鼻对广藿香饮片的快速鉴别及气味指纹图谱研究

朱广飞，王 静，钱怡洁，张科卫*，陆兔林*，毛春琴

南京中医药大学，江苏 南京 210023

通过Heracles Neo超快速气相电子鼻技术，建立广藿香饮片快速鉴别方法，建立专属性特征性强的广藿香饮片气味指纹图谱。采用Heracles Neo超快速气相电子鼻对广藿香饮片及黑龙江、四川和湖南3个产地的藿香饮片样品进行气味分析，根据获取的气味色谱信息，结合Kovats保留指数及Arochembase数据库内容，通过建立的化学计量学模型实现广藿香饮片的快速鉴别，通过2个不同极性色谱柱，即MXT-5（低极性）和MXT-1701（中极性），对广藿香饮片真实气味进行气味指纹图谱的研究。通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）、软独立建模分析（soft independent modeling of class analysis，SIMCA）3种化学计量学模型能够实现对广藿香饮片的快速鉴别，通过方法学考察得到2个不同极性色谱柱下专属性特征性强的广藿香饮片的气味指纹图谱。所建立的广藿香饮片气味指纹图谱专属性强，可以根据所建立的气味指纹图谱对广藿香饮片进行快速鉴别，为中药材的真伪快速鉴别及中药饮片整体性质量的评价控制提供新技术和新方法。

Heracles Neo超快速气相电子鼻；广藿香饮片；快速鉴别；气味指纹图谱；Kovats保留指数；主成分分析；判别因子分析；软独立建模分析

广藿香为唇形科广藿香属植物广藿香(Blanco) Benth.的地上部分，“十大南药”之一，是一味常见的清热解毒、调节胃肠道的中药[1]。广藿香原产于马来西亚、菲律宾等地，后引入我国，主产于广东、海南等地，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑等功效。现今“藿香”别名“土藿香”，为唇形科藿香属植物藿香(Fisch.et Mey.) O.Ktze的地上部分，据《中药大辞典》记载，藿香原植物主要分布于东北、华东、西南、河北及陕西等地，目前，药材主产于四川、江苏、浙江、湖南等地，具有祛暑解表、化湿和胃等功效[2]。经文献考证得知明代以前本草记载之“藿香”，均为今之广藿香.。“土藿香”是在明朝末年始出现于江浙市场并载入当时的本草中，如《本草乘雅半偈》[3]和《滇南本草》[4]。

广藿香和藿香均含有挥发性成分，广藿香中含有的挥发性成分主要有广藿香醇、广藿香酮等[5]。藿香中含有的挥发性成分与其产地有关，例如东北产藿香含有的挥发性成分主要为百里香醌含量大于70%，典型的香气成分是芳樟醇[6]，四川产藿香含有的挥发性成分主要为异胡薄荷酮、胡薄荷酮和异薄荷酮，占其挥发油总含量的73.55%，其余成分主要为烯类、醇类、酮类等[7]，江苏产藿香含有的挥发性成分主要为甲基胡椒粉、茴香醛、茴香脑等[8]。

广藿香属于芳香类中药，能散发出浓郁的芳香气味。芳香类中药又称“香药”，自古被用于瘟疫的预防。新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）属于中医“疫病”范畴[9]，广藿香在中医药防治COVID-19中也起到重要作用。经调查研究发现在收集的预防COVID-19的中药处方107首，涉及中药112味中，广藿香出现的频率大于20%[10]。因此保证广藿香饮片的质量和用药安全具有重要意义。查证历版《中国药典》后发现，《中国药典》1977年版之前历版药典以“藿香”之名收载，实为“广藿香”，而后各版药典均仅收载广藿香。这表明，传统正品藿香应为广藿香，而非藿香，而二者在形态特性、性味上又有些相似[11-13]，制成中药饮片后更加难以区分。

查阅文献发现，目前大都采用GC、GC-MS、HPLC等方法对广藿香及藿香进行研究，主要涉及其中所含有成分的种类及含量测定方面，兼有对其液相指纹图谱、气相指纹图谱的研究[8,14-18]。由于这些技术都不具有模拟人类鼻子的识别功能，因此在对挥发性成分进行研究时具有一定的局限性。电子鼻技术通过转化传感器电信号的变化而获取实验样品中挥发性成分的整体信息，将这些信息与经过训练后建立的数据库的信息加以比较，利用数据分析方法开展判断识别，从而达到模拟鼻子感官分析的效果，在分析挥发性样品时具有分析速度快、灵敏度高的优点。Heracles Neo超快速气相电子鼻作为一种新型的气味分析仪器，其原理为利用气相色谱技术对采集到的样品气味进行分离分析，根据样品不同芳香成分的响应值，通过色谱技术构建出气味指纹图谱，以达到通过气味的差别鉴定出目标样品的目的。传统电子鼻通过样品对于不同传感器的灵敏程度来确定样品可能含有的化合物。Heracles Neo超快速气相电子鼻则具有双色谱柱，双氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）的特点，可将得到的色谱图中不同色谱峰通过正构烷烃的校准，将保留时间转化为Kovats保留指数后，通过仪器自带的AroChemBase数据库对比进行气体定性、定量分析，所得到的气味指纹图谱能更全面、更特征性的定义样品[19-28]。本实验以广藿香与藿香的气味差异作为切入点，期望通过Heracles Neo超快速气相电子鼻技术，实现从气味上快速鉴别广藿香饮片以达到保证其临床疗效的目的。

1 仪器与材料

Heracles Neo超快速气相电子鼻，PAL RSI全自动顶空进样器，MXT-5（低极性，交联5%二苯基/ 95%二甲基聚硅氧烷）和MXT-1701（中极性，交联14%氰丙基苯/86%二甲基聚硅氧烷）金属毛细管柱（10 m×0.18 mm×0.4 µm），法国Alpha MOS公司；正构烷烃C6～C16混合对照品，美国Restek公司，批号A10142930。广东产广藿香饮片（yp1～yp15）共15批，市面采购湖南藿香饮片（hn1～hn10）10批，黑龙江野生藿香饮片（hlj1～hlj3）3批，四川藿香饮片（sc1～sc10）10批。经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，15批广东产广藿香饮片为唇形科植物广藿香(Blanco) Benth.干燥地上部分。黑龙江、湖南和四川藿香饮片均为唇形科藿香属植物藿香(Fisch.et Mey.) O.Ktze的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 供试品制备

将不同批次广藿香饮片和不同产地的藿香饮片分别打粉，过2号筛备用。

2.2 进样方法单因素考察

取广藿香饮片yp1供试品，采用顶空进样，固定称样量1.0 g条件下，分别对进样量、振摇温度以及振摇时间进行单因素考察。

2.2.1 进样量试验 精密称取广藿香饮片yp1供试品1 g，振摇时间20 min，振摇温度40 ℃。分别考察1000、2000、3000、4000、5000 μL进行分析。结果发现，从进样1000 μL开始，就出现了13个色谱峰，且随着进样量的增大，这13个色谱峰的响应值均变大，但未有新的色谱峰产生。在进样量为4000 μL时，13个色谱峰的峰面积、峰高、分离度与5000 μL进样量时色谱峰信息相差不大，因此选取了4000 μL作为本实验进样量。

2.2.2 振摇温度试验 精密称取广藿香饮片yp1供试品1 g，振摇时间20 min，进样体积4000 μL。振摇温度分别考察40、50、60、70 ℃进行分析，随着温度的升高色谱峰响应值逐渐变大，考虑到广藿香属于芳香性中药，在低温条件下更贴近真实环境，仪器操作说明中50 ℃以下为低温，低温条件下50 ℃时色谱峰响应最大，因此最终选取50 ℃作为本实验振摇温度。

2.2.3 振摇时间试验 精密称取广藿香饮片yp1供试品1 g，振摇温度50 ℃，进样体积4000 μL。振摇时间分别考察了10、15、20、25、30 min进行分析。随着振摇时间的延长，在20 min后色谱峰无明显变化，表明广藿香气味在20 min后趋于饱和稳定。最终选取20 min作为本实验振摇时间。

2.3 实验参数确定及进样

将15批广藿香饮片及不同产地的藿香饮片供试品按照“2.2”项下考察得到的最佳实验参数进行测定，每批平行3份，以正构烷烃C6～C16混合对照品进行校准。具体试验参数具体实验参数为样品瓶20 mL；样品量1 g；进样量4000 μL；振摇温度50 ℃；振摇时间20 min；进样速度125 μL/s；进样持续时间37 s；进样口温度200 ℃；捕集阱初始温度40 ℃；捕集阱分流速率10 mL/min；捕集持续时间42 s；捕集阱最终温度240 ℃；柱温初始温度50 ℃；程序升温：以1 ℃/s至80 ℃，以3 ℃/s至250 ℃，保持21 s；采集时间110 s；FID增益12。

2.4 广藿香饮片气味指纹图谱研究

2.4.1 指纹图谱的建立与分析 按照“2.3”项确定的测定参数，通过Heracles Neo超快速气相色谱电子鼻对15批广藿香饮片进行检测，将得到的图谱信息导入Origin 2018函数绘图软件中获得2根不同极性色谱柱MXT-5（低极性）和MXT-1701（中极性）的气味指纹图谱，结果见图1、2。结果表明，采用Heracles Neo超快速气相色谱电子鼻技术，从广藿香饮片的气味指纹中检测到13个共有峰，其中，70 s前所出的色谱峰峰面积比较小，70 s后所出的色谱峰峰面积比较大，其中9号色谱峰面积最大。

图1 15批广藿香饮片(yp1～yp15) 的Heracles Neo气味指纹图谱

Fig.1 Odor chromatogram of Heracles Neo of 15 batches of P.cablin (yp1—yp15)

2.4.2 精密度试验 取广藿香饮片yp1供试品，精密称取6份样品，各1.0 g，按照“2.3”项下确定的最佳实验参数进行测定，测得13个共有峰。记录各色谱峰峰面积及保留时间，结果显示13个共有峰的峰面积RSD值为2.79%～4.83%，均小于5.00%；13个共有峰保留时间RSD值为0.01%～0.21%，均小于3.00%；表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取广藿香饮片yp1供试品6份，分别打粉过2号筛，每份供试品各精密称取1.0 g，按照“2.3”项下确定的最佳试验参数进行测定，测得13个共有峰。记录各色谱峰峰面积及保留时间，结果显示13个共有峰的峰面积RSD值为3.18%～4.97%，均小于5.00%；13个共有峰保留时间RSD值为0.02%～0.13%，均小于3.00%；表明本实验的重复性良好。

图2 广藿香饮片Heracles Neo气味指纹图谱共有模式

2.4.4 稳定性试验 取同一广藿香饮片yp1供试品，分别于0、2、4、6、8、10、12 h时精密称取1 g，按照“2.3”项下确定的最佳试验参数进行测定，测得13个共有峰，记录各色谱峰峰面积及保留时间，结果显示13个共有峰的峰面积RSD值为2.48%～4.80%，均小于5.00%；13个共有峰保留时间RSD值为0.03～0.16%，均小于3.00%；表明该方法的稳定性良好。

2.5 广藿香饮片气味分析研究

通过与正构烷烃C6～C16混合对照品的保留时间相比对，将“2.4”项下测得的广藿香饮片中的13个共有峰保留时间（R）转换成Kovats保留指数（RI）后，经AroChemBase数据库导出比对结果，结果见表1。图2及表1结果表明，广藿香中所含的化合物主要为烯烃和烷烃，其中峰面积最大的9号峰可能为β-石竹烯。

表1 广藿香饮片中可能化合物及感官描述信息

2.6 广藿香饮片与藿香饮片气味比较研究

将收集到的藿香饮片，按“2.3”项下确定的检测参数进行检测、分析，结果见表2、3和图3。

表2和图3结果表明，3批黑龙江产藿香饮片中所含有的共有峰为6个，除其中的2、7号峰与广藿香饮片色谱图（可能为丙醛和右旋萜二烯）相同外，黑龙江产藿香饮片中未检测到与广藿香饮片相同的色谱峰。因此，通过色谱图的差异能快速地将黑龙江藿香饮片与广藿香饮片区分开来。

表3和图3结果表明，湖南产藿香饮片与四川产藿香饮片所含成分相似，四川产藿香饮片所含成分仅仅比湖南产藿香饮片少了1个4号峰。这2个产地的藿香饮片都含有广藿香饮片所没有的a号峰；广藿香饮片中含有的1号峰与3号峰，这2个产地的藿香饮片中均未含有；同时，四川产藿香饮片还比广藿香饮片少了1个4号峰。10批湖南产藿香饮片含共有峰12个；10批四川产藿香饮片含共有峰11个。

表2 黑龙江藿香饮片中可能化合物及感官描述信息

表3 湖南藿香饮片及四川藿香饮片中可能化合物及感官描述信息

从40～70 s间广藿香饮片色谱图中出峰峰高、峰形与湖南、四川藿香饮片出峰峰高与峰型相差较大，通过色谱图的差异可以明显区分出广藿香饮片。

2.7 广藿香饮片的快速鉴别研究

2.7.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA是一种多元统计方法，它可以将采集的多指标进行数据转换和降维，并对降维的特征向量进行线性分类，捕捉整个数据集间的最大差异，呈现二维图或三维图。PCA可以在没有任何样品信息的条件下，迅速浏览所有数据，找出它们之间的相关性，建立一个合理的模型[29]。

将通过Heracles Neo超快速气相电子鼻获取的不同产地的藿香饮片及广藿香饮片粉末的色谱峰面积以及峰数量，筛选出区分能力强且峰面积较大的色谱峰作为传感器，进行PCA，结果如图4所示，横、纵坐标分别表示通过PCA转换得到的第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）的贡献率，PC1与PC2累积贡献率为98.395%，能够较好地反映所测样品中气味信息。

识别指数为正数说明组与组间没有交叉数据，组与组间识别信息良好，识别指数越大说明组与组之间差别越大，识别指数70，说明超快速气相电子鼻能快速有效地鉴别出广藿香饮片。

图3 广藿香饮片及不同产地藿香饮片气味指纹图谱共有模式对比

图4 广藿香饮片及不同产地藿香饮片的PCA图

2.7.2 判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA） DFA是判定个体所属类别的统计分析方法，它通过2个或多个已知类别的样本数据优化区分，使组间距离最大的同时保证组内差异最小，用于定性判别[30]。

对广藿香饮片及3个不同产地的藿香饮片进行DFA，结果如图5所示，横、纵坐标分别为通过DFA转换得到的判别因子1和判别因子2，且判别因子1和判别因子2累积区分指数为99.638%，说明通过DFA法可以有效地区分出广藿香饮片且区分效果良好，所得趋势及结果与PCA相同，使PCA结果得到进一步验证。

2.7.3 软独立建模分析（soft independent modeling of class analysis，SIMCA） SIMCA是一种定性分析手段，用于简单的判别，能够给出好与坏或者合格与不合格的分析结果，并通过逐个验证样本的交叉有效性来计算识别百分比[31]。以广藿香饮片为参照对3类不同产地的藿香饮片进行SIMCA，结果如图6所示。由图6可以看出，湖南、四川和黑龙江产藿香饮片均在参照区域外，说明SIMCA为有效模型，能对广藿香饮片与不同产地的藿香饮片进行准确的区分，可以用来快速识别广藿香饮片。

图5 广藿香饮片及不同产地藿香饮片的DFA图

图6 广藿香饮片及不同产地藿香饮片的SIMCA

3 讨论

通过Heracles Neo超快速气相电子鼻对15批广藿香饮片及10批湖南藿香饮片、10批四川藿香饮片、3批黑龙江藿香饮片进行气味分析，通过对比气味图谱发现3个产地的藿香饮片与广藿香饮片存在较大差异，可以通过气味指纹图谱对广藿香饮片有一个较好的鉴别，因此对15批广藿香饮片且通过方法学考查所得到的2个不同极性色谱柱下的广藿香饮片的气味指纹图谱，共13个共有峰，可作为广藿香饮片从气味上特征性定义的依据，且通过AroChemBase数据库对广藿香饮片气味指纹图谱中的13个特征峰进行了定性分析，较为全面的表述了广藿香饮片的真实气味及气味成分组成，为广藿香饮片质量的分析与控制提供了新方向。

此外，基于Heracles Neo超快速气相电子鼻对15批广藿香饮片及3个不同产地的藿香饮片进行气味分析所得到的气味信息，通过PCA、DFA、SIMCA 3种统计分析，均能实现对广藿香饮片与黑龙江、湖南和四川3地的藿香饮片的快速识别，且3种模型起到了相互验证的作用。综前所述，Heracles Neo超快速气相电子鼻可以作为一种快速鉴别广藿香饮片区别于藿香饮片的有效方法，且通过其特有的双色谱柱对广藿香饮片的气味指纹图谱进行研究，可以对其质量进行整体特征性评价，为芳香性中药饮片的质量控制提供新思路。

目前，Heracles Neo超快速气相电子鼻主要在食品领域应用比较广泛[19,24,30,32]，对于含有挥发性成分或具有强烈气味的中药饮片辨识中也有应用[29,31]，对于气味不强烈或挥发性成分含量较低的中药饮片则应用性不强。因此，使用该技术进行研究时，可以通过结合GC/MS、HPLC/MS等技术，更全面地反映所研究样品的信息。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Rapid identification ofand its odor fingerprint based on Heracles Neo ultra-fast gas phase electronic nose

ZHU Guang-fei, WANG Jing, QIAN Yi-jie, ZHANG Ke-wei, LU Tu-lin, MAO Chun-qin

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

By Heracles Neo ultra-fast gas-phase electronic nose technology, a rapid identification method for Guanghuoxiang (, PH) was established, and the odor fingerprint of PH with strong specific characteristics was established.Heracles Neo ultra-fast gas phase electronic nose was used to analyze the odor of PH and Huoxiang samples from Heilongjiang, Sichuan and Hunan province.According to the obtained odor chromatographic information, combined with the Kovats retention index and the Arochembase database, the rapid identification ofwas obtained with established chemometric model.MXT-5 (low polarity) and MXT-1701 (medium polarity) were used to analyse the odor fingerprint of.A rapid identification method forwas achieved by three chemometric PCA ( principal component analysis), DFA (discriminant factor analysis) and SIMCA (soft independent modeling of class analysis).And the specific odor fingerprints ofby two different polarity chromatographic columns were obtained.The establishedscented fingerprints of decoction pieces were highly specific, and could be used to quickly identifyscented pieces based on the established odor fingerprints, providing new ways for the rapid identification of authenticity of Chinese medicinal materials.

Heracles Neo ultra-fast gas phase electronic nose;; quick identification; odor fingerprint; Kovats retention index; principal component analysis; discriminant factor analysis; soft independent modeling of class analysis

R283.6

A

0253 - 2670(2022)05 - 1320 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.005

2021-08-28

国家重点研发专项——中药饮片质量识别关键技术研究（2018YFC1707000）

朱广飞（1996—），男，硕士研究生，主要从事中药炮制及中药饮片质量标准研究。Tel: 18614981986 E-mail: 2536586207@qq.com

通信作者：张科卫，博士，副教授，主要从事中药炮制与饮片质量研究。E-mail: kewei@njucm.edu.cn

陆兔林，教授，博士生导师，主要从事中药炮制及中药饮片质量标准研究。E-mail: lutulin2005@126.com

[责任编辑 郑礼胜]