一株假单胞菌的分离鉴定及其在青海地区堆肥中的应用潜力

张鑫鹏，王 信，孙 健，伊国云，李松龄

(青海大学 农林科学院，青海 西宁 810016)

油菜是青海省的第三大种植作物，目前种植面积在14.67万hm左右。油菜秸秆既含有丰富的营养物质，又含有较多的纤维素，而纤维素在堆肥过程中较难降解。在利用油菜秸秆堆肥时，向其中加入纤维素降解菌剂，利用微生物降解纤维素，是解决这一问题的有效措施之一。近年来，国内外学者已筛选出部分纤维素高效降解菌株，并将其应用到玉米、水稻、小麦秸秆上。例如：王洪媛等筛选出3株纤维素降解真菌，其中，W4菌株表现出较好的秸秆降解能力；于慧娟等筛选出5株真菌，以绿色木霉作为对照菌株，进行小麦秸秆降解试验，发现筛选出的真菌的降解率比绿色木霉高2倍以上；Abdel-Rahman等向水稻秸秆堆肥中添加纤维素降解菌，发现添加菌剂的处理，堆肥腐熟快，且产品质量高；谢宇新等从环境中分离到一株低温降解菌，在-20 ℃的低温堆肥中加入此菌能使堆温迅速升高，堆肥1～2 d后堆温可达55～65 ℃；孟建宇等从内蒙古地区的土壤中分离出36株纤维素降解菌，其中，属于假单胞菌属(sp.)的有10株，且这些菌在10 ℃以下环境中的酶活相对较高。

基于上述研究，本文首先在青海当地分离土著菌，从中筛选出纤维素降解能力强的菌株，制成微生物菌剂，然后以猪粪、油菜秸秆为原料，加入制成的微生物菌剂，研究堆肥理化指标的动态变化，以期筛选出适宜青海当地气候条件堆肥发酵的微生物菌剂，为实现当地油菜秸秆等农业废弃物的资源化利用提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

土壤样品于2019年4月在青海省西宁市北山土楼观(36°38′28″N，101°46′18″E，海拔2 380 m)采集，采样时的环境温度为20 ℃。取样地土壤类型为灰钙土，土壤颜色为红色，pH值为7.5，质地为黏土，砂石含量30%，植被类型为常绿针叶林油松林。采样区气候冷凉，属高原大陆性半干旱气候，年平均气温6 ℃，昼夜温差大。

1.1.2 培养基

富集液体培养基：酵母粉2 g，NaCl 0.1 g，KHPO1.0 g，CaCl0.1 g，NaNO2.5 g，FeCl0.01 g，MgSO0.3 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

细菌培养基：酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

羧甲基纤维素钠固体培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0 g，KNO1.0 g，KHPO0.5 g，MgSO0.5 g，NaCl 1.5 g，刚果红0.2 g，琼脂16 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

液体产酶培养基：油菜秸秆粉10 g(粉碎后过2 mm筛)，KHPO1 g，MgSO0.3 g，NaNO2.5 g，CaCl·6HO 0.1 g，NaCl 0.1 g，FeCl0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

1.1.3 堆肥原料

堆肥原料中的猪粪取自青海泰和源农牧科技有限公司，秸秆由互助县青海昱青生物科技有限责任公司提供。油菜秸秆截成3～5 cm小段。将上述2种堆肥原料的部分理化性质整理于表1。

表1 堆肥原料的部分理化性质

1.2 微生物菌剂制备

1.2.1 纤维素降解菌株初筛

取10 g土壤样品加入90 mL装有滤纸的富集液体培养基中，置于恒温摇床振荡，待滤纸断裂后，取5 mL样品转接至富集液体培养基中继续培养，持续转接3次。取10 mL经富集的样品于90 mL无菌水中，置于恒温摇床振荡30 min，得到10浓度梯度的菌悬液，然后依次制成10～10浓度梯度的菌悬液。取0.1 mL的各浓度梯度的菌悬液涂布于CMC-Na固体平板上，每一梯度重复3次，25 ℃培养24～72 h后，挑选单菌落反复划线于CMC-Na固体平板上，25 ℃培养48 h，然后向培养皿中加入刚果红进行染色，测量菌株的菌落透明圈直径(，cm)与菌落直径(，cm)，计算二者的比值，选择比值较大的菌株进行保存。

1.2.2 纤维素降解菌株复筛

将初筛得到的菌株接种到细菌培养基中，30 ℃、180 r·min培养24 h，制成孢子悬浮液。按照2%(体积分数)的接种量接种到液体产酶培养基中，30 ℃、180 r·min培养24 h，4 ℃、6 000 r·min离心10 min，上清液即为测定纤维素酶活所需的粗酶液。用DNS法测定纤维素酶活，具体包括羧甲基纤维素(CMC)酶活、滤纸酶活和外切--葡聚糖酶活。

CMC酶活测定：向试管中加入1 mL质量分数为1%的CMC-Na溶液、0.5 mL粗酶液、0.5 mL pH值为4.5的柠檬酸缓冲液，混合均匀后，放置于50 ℃水浴锅中反应30 min，取出后加入1.5 mL二硝基水杨酸(DNS)，摇匀，100 ℃水浴10 min，待冷却后，加入10 mL蒸馏水，测定波长540 nm处的吸光值。

滤纸酶活测定：向试管中加入50 mg的滤纸、0.5 mL粗酶液、1.5 mL pH值为4.5的柠檬酸缓冲液，其余方法同CMC酶活测定。

外切--葡聚糖酶活测定：向试管中加入1 mL质量分数为1%的微晶素底物溶液，其余方法同CMC酶活测定。

基于测定的各菌株的纤维素酶活，对降解菌株进行复筛。

1.2.3 菌株鉴定

菌株形态观察和生理生化特性检测参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。

菌株的16S rDNA基因检测：采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取菌株DNA。采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)：10×PCR缓冲液2 μL，引物(10 μmol·L)各0.5 μL，Plus DNA Polymerase(5 U·μL)0.5 μL，dNTP(10 mmol·L)0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddHO 14 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸 8 min。将PCR扩增后的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，应用MEGA 5.0软件采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，用Bootstrap进行检验，重复次数为1 000次。

1.2.4 微生物液体菌剂的制备

将筛选出的纤维素降解菌株接种于细菌培养基中，30 ℃、180 r·min振荡培养36 h，待菌液浓度达到1×10CFU·mL，即为液体微生物菌剂。

1.3 堆肥试验设计

堆肥试验于2020年6月1日—7月20日在青海大学教学实践基地温室大棚中进行，共持续50 d。试验设置2个处理，分别为试验组和对照组，每组均设置3个重复。

堆肥时，用新鲜猪粪和油菜秸秆按体积比3∶1的比例进行混合。同时，分别按照物料总质量的0.1%和1%的比例添加麸皮和麻渣。混匀后，建成长、宽、高分别为1.8、1.5、0.6 m的条垛式堆体，堆体的C/N在(25～30)∶1，水分含量控制在55%～60 %。试验组按照10 mL·kg的比例添加液体微生物菌剂，对照组不添加微生物菌剂，其他物料添加量均与试验组相同。

各组中的物料搅拌均匀后，用塑料覆盖保温，成堆进行发酵。采用人工翻堆的方式补充堆内的新鲜空气。自堆制开始，第3天进行第一次翻堆，之后每隔3 d翻堆一次。

取样时，采用五点取样法于四周和中心分别取样，取样高度为堆高的1/2处，每样点取500 g样品，混合后分为2份：一份于4 ℃保存；一份风干后粉碎，过40目筛。自制堆开始，分别于0、7、16、24、32、40、50 d取样。

1.4 指标测定

自堆肥开始，于每日10：00和16：00各测量1次堆体温度，在堆体中上部(30 cm)随机选取5个点，各使用1只LCD-105型插入式数字温度计(衡水正旭电子科技有限公司)进行测量，以5个点的平均值作为该时间点堆体的实际温度，以每日2个时段堆体温度的平均值作为当日的堆体温度，同时记录堆肥周围的环境温度。

称取样品5 g，用50 mL蒸馏水(经煮沸驱除CO)浸提，160 r·min振荡30 min，后静置10 min，用雷磁PHS-3E型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)和DDS-307A型电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定样品pH值和电导率(EC)。

参照文献[12]中的方法测定种子发芽指数(GI)，参照行业标准NY 525—2012《有机肥料》测定样品的全氮含量和有机质含量。

称取一定质量的样品装于铝盒(质量已知)中，放入105 ℃烘箱烘干，直到前后2次称量(间隔2 h)的质量差小于0.01 g为止，再次称量。根据样品的质量变化，计算含水率。

堆肥开始前，向堆体中放入12个装有20 g油菜秸秆的尼龙袋，分别在堆肥的1、15、30、50 d各取出3个尼龙袋(每袋作为1个重复)，测定剩余秸秆的质量，基于油菜秸秆的质量变化计算降解率。

1.5 数据分析

用SPSS 25.0软件进行方差分析，对有显著(<0.05)差异的，采用Student’stest进行检验。采用Origin 2019软件制图。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选与鉴定

从采集的土壤样本中分离纯化得到5株滤纸降解能力较强的菌株，分别将其编号为HK-15-4、HK-15-5、HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8。基于刚果红染色法测定的菌株透明圈()和菌落直径()(表2)，选择值较高的3株菌(HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8)进行复筛。经检测，HK-15-6菌株的纤维素酶活在供试菌株中最高(表3)。综合上述结果，选择菌株HK-15-6作为后续研究的对象。

表2 供试菌株的透明圈直径(D)与菌落直径(d)

表3 部分供试菌株的纤维素酶活性

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态与生理生化鉴定

菌株HK-15-6在细菌培养基平板上于25 ℃培养24 h，呈黄色半透明圆形菌落，表面光滑且湿润，质地均匀，有光泽，边缘整齐呈地毯状。

生理生化测试结果表明：菌株HK-15-6为好氧性细菌，可分解葡萄糖产酸，但不能分解蔗糖产酸，革兰氏染色、VP试验、甲基红试验、柠檬酸盐试验均为阴性，菌株具有运动力。

2.2.2 分子鉴定

用细菌通用引物扩增菌株HK-15-6，测序后，经Blast比对，构建系统发育树(图1)。结果显示，该菌株与sp.(MW936631)的亲缘关系最近。

图1 菌株HK-15-6的系统发育树

综合形态学、生理生化鉴定和分子鉴定结果，将菌株HK-15-6鉴定为假单胞菌属(sp.)。

2.3 堆肥过程中堆体理化性质的变化

2.3.1 温度

一般来说，堆肥过程会经历升温期、高温期、降温期、腐熟期。与对照组相比，试验组的堆体温度上升较快，在堆肥第1天就达到51.5 ℃，而对照组在第2天才升至50 ℃。对照组和试验组堆体温度维持在50 ℃以上的时间分别为14 d和26 d，最高温度分别为66.8 ℃和69.2 ℃。进入降温期后，对照组和试验组的堆体温度差值缩小，分别在36 d和32 d堆体温度降至50 ℃以下。与对照组相比，试验组堆体升温较快，且高温(>50 ℃)期的持续时间长，堆体进入降温期的时间较早，说明添加菌剂加快了堆肥的腐熟进程。

国家标准GB 7959—2012《粪便无害化卫生要求》指出，堆肥过程中堆体温度达50 ℃以上并至少持续10 d才可杀死粪便中的致病菌及其有害物质。对照此标准，对照组和试验组均满足要求。

图2 堆肥过程中的温度变化

2.3.2 pH值

堆肥过程中，微生物活性与pH值密切相关，当pH值为7.0～8.5时，堆肥中微生物的活性和繁殖力最优。同时，pH值也是评价堆肥是否腐熟的重要指标。本研究中，试验组和对照组的pH值总体来说均呈先升高后降低再上升最后趋于稳定的变化趋势(图3)：在堆肥升温期，堆体的pH值稳定在8左右；当堆肥进行到24 d时，pH值迅速下降，之后又急剧上升，于32 d时达到峰值，之后又缓慢下降；至堆肥腐熟阶段，堆体的pH值稳定在7.8～8.1。2个处理的pH值均达到行业标准NY 525—2012《有机肥料》对pH值的要求(pH值为5.5～8.5)。

点上无相同小写字母的表示同一测定时间不同处理下差异显著(P<0.05)，无相同大写字母的表示同一组不同测定时间下差异显著(P<0.05)。下同。

2.3.3 EC值

EC值可反映堆肥中可溶性盐的含量，若EC值过高，说明堆肥中盐类过多，对植物生长会有抑制作用。随堆肥时间延长，试验组和对照组堆体的EC值均呈逐渐增加的趋势，到腐熟阶段趋于稳定(图4)。在堆肥的16—50 d，试验组的EC值显著(<0.05)低于对照组。至堆肥结束时，试验组、对照组的EC值分别为0.88、1.02 mS·cm。研究表明，堆体的EC值小于4 mS·cm，说明堆肥已腐熟，达到安全使用标准。本研究堆肥结束时，试验组和对照组的EC值均符合此要求。

图4 堆肥过程中电导率(EC)的变化

2.3.4 发芽指数(GI)

GI是评价堆肥腐熟的重要指标。当GI达80%～85%时，说明堆肥已基本腐熟。随堆肥时间延长，试验组和对照组的GI均呈上升趋势(图5)。堆肥前期(0—16 d)，试验组和对照组的GI值差异较小，仅7 d时差异达显著水平(<0.05)；随后，两组的差值逐渐扩大，试验组的GI显著(<0.05)高于对照组。至50 d时，仅试验组的GI达85%以上，为90%，比对照组高出12百分点。这说明，添加菌剂对堆肥的促腐效果明显。

图5 堆肥过程中种子发芽指数(GI)的变化

2.3.5 含水率

堆体含水率是影响堆肥进行的重要因素。堆肥开始时，堆体含水率在55%～65%较为适宜，超过65%时，堆肥会变成厌氧发酵。由于堆肥过程中堆体的含水量调节成本高且不易控制，为此，本研究特在堆肥初期将含水率控制在58%。随着堆肥时间推进，无论是试验组还是对照组，堆体的含水率均显著(<0.05)下降(图6)。两组相比，除0、16 d外，其他时间对照组的含水率均显著(<0.05)高于试验组。至堆肥结束时，试验组含水率为24.29%，对照组含水率为28.75%，均符合行业标准NY 525—2012《有机肥料》的相关要求。

图6 堆肥过程中含水率的变化

2.3.6 全氮和有机质

堆肥前后相比，无论是试验组还是对照组，其全氮含量均无显著差异；但两组相比，堆肥结束后，试验组的全氮含量显著(<0.05)高于对照组。与全氮含量变化不同的是，无论是试验组还是对照组，堆肥后的有机质含量均较堆肥前显著(<0.05)降低，降幅分别为27.8%和18.4%；堆肥结束后，试验组的有机质含量显著(<0.05)低于对照组。这说明，添加菌剂更有利于堆体物料中有机质的降解。

2.3.7 降解率

整体来看，随着堆肥进行，试验组和对照组的降解率均显著(<0.05)升高，且在堆肥期间(15—50 d)试验组和对照组的降解率差异显著(<0.05)。这说明，菌剂的加入在堆肥过程中加速了纤维素的降解。堆肥结束时，对照组的降解率仅为30.8%，而试验组达45.6%，较对照组提高14.8百分点。

表4 堆肥过程中全氮和有机质含量的变化

图7 堆肥过程中降解率的变化

3 讨论

筛选出适合青藏高原冷凉气候条件，且纤维素降解能力强的菌株，对于青海地区数量巨大的油菜秸秆和猪粪等废弃物的资源化利用来说十分关键。目前，已经筛选出的纤维素降解菌数目庞大，但适宜青海地区堆肥发酵的菌株相对较少。本研究在常温条件下筛选得到1株纤维素降解能力强的菌株HK-15-6，经鉴定为假单胞菌属。该菌属于常温菌，在30 ℃的培养条件下可生产、制作成微生物菌剂。经检测，HK-15-6菌株的滤纸酶活为20.58 U·mL，低于尚晓瑛等筛选的B6-15菌株(同为假单胞菌属)的滤纸酶活(24.94 U·mL)，这可能是因为本研究未对该菌株的产酶条件进行优化。后续试验可考虑对其产酶条件进行优化，这样将更有利于该菌株在青海地区堆肥发酵中的应用。

将分离得到的菌株制成液体微生物菌剂，用于猪粪和油菜秸秆的堆肥试验，结果表明，添加菌剂的试验组，堆温升至高温期的用时较短且高温持续时间长，至堆肥结束时，其全氮含量和种子发芽指数都更高。李晓宇等筛选出3株芽孢杆菌，研究其在牛粪堆肥上的效果，结果表明，添加菌剂的处理在堆肥第3天即进入高温期并持续了16 d，最高堆温为65.4 ℃；李昌宁等的堆肥试验，在堆肥第2天即进入高温期，高温期持续25 d；孙元烽等的堆肥试验中，55 ℃以上的高温期维持10 d。与上述研究相比，本研究在堆温方面的表现最好，堆体很快地进入高温期(2 d)，高温持续时间长(26 d)，且最高温度为69.2 ℃。虽然青海地区昼夜温差大，但该菌株仍表现出较好的堆肥效果，显示出较强的应用潜力。