肉牛呼吸道皮特不动杆菌的生物学特性分析

樊利虹，王之盛，左之才，*，才冬杰，易 军，马晓平，苟丽萍，王 巍

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学 动物营养研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

皮特不动杆菌()属于莫拉菌科，不动杆菌属，不运动的革兰氏阴性球杆菌，其广泛存在于自然界，可定植在土壤、污水、蔬菜、皮肤、医疗器械等环境中。该菌的营养需求不高，能够在以乙酸为唯一碳源，氨为唯一氮源的矿物介质中生长，并且在25～41℃之间都能生长；其生化特性与大部分不动杆菌相似，严格好氧，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，葡萄糖非发酵型，吲哚阴性。近年来，皮特不动杆菌的临床分离率逐渐升高。在引起人类的感染中，皮特不动杆菌被报道为院内感染重要的条件致病菌，可导致院内病人菌血症、肺部和尿路感染等；还可引起水生动物武昌鱼、泥鳅和斑马鱼的菌血症，也可能与犬猫呼吸道疾病(化脓性鼻炎和支气管炎)有关。但目前关于肉牛源皮特不动杆菌相关的报道极少。

随着肉牛养殖业的发展，因长途运输所致的肉牛呼吸道综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)时有发生，给肉牛养殖业带来了巨大的经济损失。因导致该病的病原种类繁多，防控难度加大，深入研究其继发或伴发感染细菌的生物特性利于提高对发生BRDC的新认识。2018年来，我们多次从发生BRDC且病情反复的病牛鼻拭子中分离到不动杆菌，包括有鲍曼不动杆菌、皮特不动杆菌、醋酸钙不动杆菌等，本文对5株皮特不动杆菌的分离情况、生化特性、16S rDNA和基因序列同源性分析及多位点序列分型(MLST)进行了研究，以期对该菌的生物特性有新的认识，为临床皮特不动杆菌感染的重视和用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

皮特不动杆菌分离自2018年7月四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7)、宜宾(ZZCJL1807-8)、什邡(ZZCSF1807-9)等地发生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子。发病牛表现有体温升高(达41℃)、流鼻液、呼吸困难、口有泡沫、部分牛有口腔溃疡等症状，但蹄部、关节等无异常，有阿莫西林、青霉素、头孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板蓝根等用药史，但病情总是反复。

1.2 主要试剂与培养基

营养肉汤(NB)、革兰氏染色液、血液琼脂基础(青岛高科园海博生物技术有限公司)；麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)；微量生化管(杭州微生物试剂有限公司)；琼脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色剂(北京索莱宝科技有限公司)；细菌基因组提取试剂盒、DL 2000 DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)；Premix Taq(宝生物工程大连有限公司)。

1.3 引物的设计与合成

参照文献[18]设计细菌16S rDNA基因通用引物和引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释至10 μmol·L，-20 ℃保存备用。

表1 实验用引物序列

1.4 细菌的培养特性

将5株皮特不动杆菌分别接种于营养琼脂平板，37 ℃恒温培养18～24 h，观察细菌生长情况。再分别划线接种于普通营养琼脂培养基、兔血琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况；并挑取单个菌落涂片、革兰氏染色镜检，观察菌体形态。

1.5 生化特性

对菌株进行氧化酶、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、侧金盏花醇、枸橼酸盐、丙二酸盐、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、硫化氢、吲哚、MR-VP和明胶等生化试验。依据细菌微量生化管说明书判定生化试验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行结果分析。

1.6 16S rDNA和gyrB序列扩增及遗传进化分析

提取菌株的基因组DNA，进行16S rDNA和基因序列扩增，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果与GenBank数据库进行BLAST比对分析，并构建系统进化树和进行同源性分析。

1.7 MLST分型

参照文献[21-22]，根据MLST(Pasteur)数据库公布的7个看家基因(60、、、、、、)的引物序列对分离细菌基因组DNA进行PCR扩增，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将所得序列提交至MLST数据库比对，进行序列型(sequencetype，ST)分析。

2 结果与分析

2.1 革兰氏染色形态

5株皮特不动杆菌菌体形态相似，均为球杆状的革兰氏阴性菌(图1)。

图示A、B、C、D、E分别代表菌株ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

2.2 菌落形态观察

37 ℃条件下培养24 h后，5株菌在不同培养基上菌落形态大小均相似。在普通营养琼脂平板上呈圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐、微隆起、不透明的白色菌落(图2 A1-E1)；在血平板上培养均无溶血现象，菌落呈白色圆形，边缘半透明(图2 A2-E2)；在麦康凯培养基上呈圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐、微隆起、不透明的淡橘色菌落(图2 A3-E3)；在伊红美蓝培养基上呈圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐、微隆起、不透明的淡紫色菌落(图2 A4-E4)。

图示1、2、3、4分别代表各菌株在普通营养琼脂培养基、血琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基上的菌落形态。

2.3 生化试验结果

5株菌的氧化酶、覃糖、血清菊糖、侧金盏花醇、水杨素、硝酸盐还原、苯丙氨酸、七叶苷、吲哚、硫化氢、明胶和VP试验均为阴性；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、DNA酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、氨基酸脱羧、动力试验均为阳性。各菌株间比较发现，部分菌株的部分生化特性与其他菌株完全不同，表现在ZZCNC1807-6蔗糖、甘露醇、丙二酸盐、MR试验为阳性；ZZCNC1807-7的乳糖、蔗糖、丙二酸盐、甘露醇试验为阳性；ZZCSF1807-9的枸橼酸盐、精氨酸双水解试验为阳性，丙二酸盐试验为阴性；ZZCNC1807-4和ZZCJL1807-8的生化特性完全一致。综上可见，来自于牛源的5株菌表现出4种不同的生化类型，其中ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCSF1807-9的部分生化特性如乳糖、MR试验、枸橼酸盐、精氨酸双水解试验等发生了变化(表2)。

表2 部分生化试验结果

2.4 菌株16S rDNA序列分析

5株菌的16S rDNA基因扩增产物片段大小约为1 500 bp(图3)，其测序结果经Blast比对分析，结果显示，与皮特不动杆菌的同源性为99%。系统进化树(图4)显示：5株菌均与皮特不动杆菌(NR117930和NR117621)同在一个分支，表明与皮特不动杆菌亲缘关系最近。16S rDNA序列同源性分析结果(图5、表3)显示：5株菌的同源性为100%，均与来源于血液(人)、太阳鸟泄殖腔液皮特不动杆菌的同源性为100%，与豇豆源皮特不动杆菌的同源性为99.9%，与痰液、城市污水、泥鳅皮特不动杆菌的同源性达99.5%，与麦田、根际土壤、武昌鱼、鲢鱼、白纹伊蚊幼虫源的同源性为90%以上，而与石油污染土壤中分离的皮特不动杆菌同源性仅达81%。

M，DNA 分子质量标准；1，阴性对照；2～6，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

图4 16S rDNA基因系统进化分析

图5 16S rDNA基因同源性分析

表3 皮特不动杆菌的16S rDNA参考序列

2.5 菌株gyrB基因序列分析

5株菌的基因扩增产物片段大小约为700 bp(图6)，其测序结果经Blast比对分析，结果显示，与皮特不动杆菌的同源性为99%。基因系统进化树(图7)显示：5株菌均与皮特不动杆菌(LC102633)聚类在一起，而ZZCSF1807-9与另4株菌并未完全聚集在同一分支。基因序列同源性分析结果(图8、表4)显示：ZZCSF1807-9与另4株菌的同源性仅为97.1%，而其余4株菌之间的同源性为100%；ZZCSF1807-9与澳大利亚(CP042364)、韩国(CP017938)、马来西亚(CP014477)人源皮特不动杆菌的同源性分别为99.7%、98.5%、97.4%，另4株菌与其同源性分别为97.4%、97.1%、99.7%；ZZCSF1807-9与河南鱼源(CP035109)皮特不动杆菌的同源性为97.9%，另4株菌与其同源性为99.1%；而5株菌与表中其他来源的皮特不动杆菌的同源性均低于50%。根据上述结果，可初步将5株菌分为两类：ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8为一类，ZZCSF1807-9为另一类。

图6 分离菌株gyrB序列PCR扩增

图7 gyrB基因系统进化分析

图8 gyrB基因同源性分析

表4 皮特不动杆菌的gyrB参考序列

2.6 MLST分型

将上述7个管家基因PCR产物交由上海生工测序，测序结果经整理后上传MLST数据库进行比对，再将5株菌与其他ST型菌株进行聚类分析。结果显示(图9)，菌株ZZCSF1807-9为ST214型，其余4株菌分型结果一致，与ST321型最为接近。

图9 MLST聚类分析结果

3 讨论

研究发现，不动杆菌感染发病率呈一个全球季节性模式，发病率峰值出现在夏季/温暖月份，而低谷出现在冬季/寒冷月份。本实验中的皮特不动杆菌来源于高温多雨的夏季从患有呼吸道疾病的肉牛鼻拭子中分离得到。通过对5株菌进行菌体形态观察、培养特性和生化特性研究，以及16S rDNA和基因序列聚类等研究发现，该5株菌的菌体形态和培养特性与大部分不动杆菌一致。将生化结果与不同来源菌株之间比较显示，来自患呼吸道疾病肉牛的5株皮特不动杆菌和印度淡水鱼源皮特不动杆菌均可以利用葡萄糖和阿拉伯糖，而Li等报道的3株武昌鱼源皮特不动杆菌的葡萄糖和阿拉伯糖试验均为阴性；5株来自肉牛呼吸道的皮特不动杆菌与武昌鱼源菌株的赖氨酸脱羧酶均为阳性，而印度淡水鱼源皮特不动杆菌为阴性。同时，5株分离菌之间比较发现，ZZCSF1807-9与其余4株菌的部分生化特性存在不同。其中，ZZCSF1807-9的枸橼酸盐利用试验结果为阳性、丙二酸盐为阴性，而另4株菌枸橼酸盐为阴性、丙二酸盐为阳性；且菌株ZZCSF1807-9的精氨酸双水解试验结果与引起武昌鱼发生败血症死亡的皮特不动杆菌一致，为阴性，而另4株菌为阳性。这可能因生活环境的不同，部分菌株为增强其环境适应力而导致细胞壁增厚，阻碍了某些酶的分泌，使其生化反应发生改变。

因皮特不动杆菌与醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体中的其他成员的基因组和表型特征非常接近，16S rDNA基因序列的多态性不足以将其完全区分开，因此进一步对5株菌进行了基因序列分析和MLST分型。结果发现，ZZCSF1807-9与其余4株菌存在进化距离，同源性仅为97.1%。同时，将5株菌与其它来源的皮特不动杆菌进行同源性分析显示，ZZCSF1807-9与人源皮特不动杆菌之间的同源性较高，为99.7%；而其余4株菌与分离自患病鱼类皮特不动杆菌的同源性较高，为99.1%。MLST分型结果显示，ZZCSF1807-9为ST214型，与2012年和2017年院内病人痰液、尿液分离株为同一型；其余4株与ST321型最为接近，而目前报道的ST321型分离株主要来自院内病人的血液和下呼吸道。但该5株菌的MLST型均与被报道可能为引起鱼类感染的优势菌株ST839型皮特不动杆菌不同。上述情况发生可能因宿主不同或地域环境差异，以及抗菌药物的大量使用，而导致不同来源菌株的基因发生改变。

综上可见，牛源皮特不动杆菌在部分生化特性表型(如葡萄糖、阿拉伯糖、枸橼酸盐、丙二酸盐和精氨酸双水解等)和基因以及MLST分型出现了变化；揭示了在不同地域或养殖场环境的影响下，皮特不动杆菌的生化特性以及毒力强弱会发生一些适应性的变化。同时，本实验结果可为探究该养殖场皮特不动杆菌的感染来源及其传播途径提供一定的参考，然而关于该菌是否与肉牛呼吸道疾病的发生有关，还有待进一步研究。