清水苜蓿土壤浸提液对连作马铃薯根际土壤环境酶活性和微生物群落的影响

2022-03-03袁文雅康益晨杨昕宇张茹艳周春涛陈喜鹏余慧芳秦舒浩

浙江农业学报 2022年2期

袁文雅，康益晨，杨昕宇，张茹艳，周春涛，王勇，陈喜鹏，余慧芳，秦舒浩

(甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730070)

马铃薯(L.)具备产量高、耐贫瘠、易管理等优良性状，栽培面积不断扩大，已逐渐成为我国多地的主栽作物。西北地区是我国马铃薯主产区之一，日趋加剧的连作障碍严重影响该地区马铃薯生产力，伴随着马铃薯产业新格局的形成，连作障碍带来的问题急需解决。缓解或消除连作障碍，对马铃薯优质高效生产、打破马铃薯产业发展瓶颈具有重要意义。与土壤养分亏缺相比，土壤中有害微生物增加导致的土传病害对作物生产更具危害性。马铃薯在生产上极忌连作，长期连作会抑制马铃薯植株与块茎中干物质的累积，且随着连作年限的增加，地上和地下部发育均受到显著影响，干物质积累量逐年降低，最终严重影响马铃薯产量与薯块品质形成。

近年来，轮作豆科牧草成为缓解马铃薯连作障碍的有效方法之一，豆科植物特有的根瘤菌能固化空气中释放的氮，使植物更容易吸收。豆科作物轮作主要通过改变土壤氮素状况和根际其他生物理化性质来影响土壤微生物群落组成和土壤环境酶活性。已有研究证明，豆科作物轮作不仅增强了土壤环境酶活性和微生物群落的多样性，而且在一定程度上显著增加了可培养细菌和真菌的数量。苜蓿是“草田轮作”系统中应用最广泛的豆科作物，其根系复杂，在水土保持与改良、改善农田土壤物理性质和土壤质量、维护生态环境等方面发挥着极其重要的作用。目前，对马铃薯与豆科作物轮作的研究主要集中在土壤有效养分、理化性质、生长特性、品质和产量等方面，而对豆科植物和连作马铃薯土壤浸提液对马铃薯根际土壤环境酶活性和微生物群落影响的研究较少。因此，本研究旨在探讨4年龄清水苜蓿土壤浸提液对连作马铃薯根际土壤环境酶活性和微生物群落的影响，以探讨清水苜蓿土壤浸提液对连作马铃薯根际环境的改善作用，为克服马铃薯连作障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

于2019年3—9月在甘肃农业大学校内遮雨棚(36°1′N～37°9′N，106°21′E～107°44′E)进行试验。用于提取土壤浸提液的连作马铃薯和清水苜蓿分别来自甘肃农业大学定西农业科学院试验站和甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室。其中，马铃薯采用全膜垄播种植模式，为第4年连作，清水苜蓿为4年龄。土壤的基本理化性质如表1所示。

表1 供试土壤理化性质

1.2 试验处理

选择马铃薯品种新大坪进行盆栽试验，基质选择体积比为4∶1的蛭石和珍珠岩，播种前对基质进行充分消毒，以确保基质无菌。马铃薯出苗后，定期灌溉营养液，直到苗齐，然后浇灌马铃薯连作田土壤浸提液1 L对所有样本进行预处理，模拟马铃薯连作障碍。以4年龄清水苜蓿根际土壤浸提液与水5种不同配比混合液(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，分别标记为T1、T2、T3、T4、T5)为处理组，以浇灌同量水为对照组。各处理浇灌10盆，每盆600 mL。从苗期开始处理，每7 d浇灌1次，共处理4次。

1.3 供试土壤浸提液制备

分别在清水苜蓿和马铃薯采收期采用抖落法进行根际土壤的采样工作，将植株整体挖出，先去除细根和须根上不含根系的部分土壤，再抖落紧贴根系的土壤，去除异物和杂质，得到根际土壤，用无菌密封袋包裹密封，带回实验室储藏备用。浸提液制备时按土∶水=1∶5的比例混合，恒温振荡器中振荡1 h(转速150 r·min)，取出并过滤以获取浸提液，置于4 ℃冰箱中用于浇灌马铃薯盆栽基质。

1.4 样品采集

于2019年8月(马铃薯块茎膨大期)进行样品采集。采用抖根法收集根际土，各处理3个重复，每个重复取样100 g左右，分为2份，取其中一份鲜样立即测定土壤微生物群落；另一份样品在阴凉干燥处风干，研磨过2 mm筛，置于4 ℃冰箱，用于土壤环境酶活性的测定。

1.5 测定项目与方法

1.5.1 土壤环境酶活性测定

1.5.2 微生物群落测定

称取新鲜样品5 g，用无菌水在无菌条件下制备不同浓度的悬浮液(真菌、放线菌、细菌和好氧型自生固氮菌的浓度分别为10、10、10和10)，从每种悬浮液中取50 μL，接种至无菌培养基(真菌接种孟加拉红培养基，放线菌接种改良高氏1号培养基，细菌接种牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，好氧型自生固氮菌接种阿须贝无氮琼脂培养基)，真菌在25 ℃培养箱中培养5～7 d，放线菌在28 ℃培养箱中培养7～10 d，细菌和好氧型自生固氮菌在28 ℃培养箱中培养3 d，观察菌落与培养基情况。按下列公式计算以上4种菌的菌落数量：

菌落数量(CFU·g)=菌落平均数×稀释倍数×20×鲜干比。

厌氧型自生固氮菌、硝化细菌和反硝化细菌分别接种于玉米面培养基、斯蒂芬逊改良培养基和组合培养基，反硝化细菌和厌氧型自生固氮菌稀释梯度为10、10、10、10，硝化细菌采用10、10、10、10的稀释梯度，之后置于28 ℃培养箱中培养7～14 d。厌氧型自生固氮菌和硝化细菌分别采用格里斯试剂和二苯胺试剂显色，反硝化细菌采用奈氏试剂显色，所有操作过程均在无菌条件下进行，最后依据分析得出各自的数量指标与各种菌的近似值。

计算公式为：菌落数量(MPN·g)=近似值×数量指标首位稀释倍数×鲜干比。

1.6 数据处理

采用Origin 2018软件绘图，利用SPSS 25.0进行方差分析(LSD法)，比较差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯根际土壤酶活性的影响

由图1可知，不同浓度清水苜蓿土壤浸提液处理后土壤蔗糖酶活性均显著(<0.05)高于对照组，T1、T2、T3、T4和T5处理较对照组分别提高29.27%、38.56%、51.70%、18.65%和37.78%(图1-A)；各处理组的土壤过氧化氢酶活性均显著(<0.05)高于对照组，其中，T1、T4处理的过氧化氢酶活性较高，分别比对照组提高8.93%和10.14%(图1-B)；除T5处理外，其他处理的脲酶活性均高于对照组，T1、T3、T4处理较对照组分别提高33.37%、55.27%和52.57%，T3、T4处理差异不显著(图1-C)；T4处理的碱性磷酸酶活性高，较对照组提高47.65%(图1-D)。

CK，对照组(灌溉等量水)；T1～T5，清水苜蓿根际土壤浸提液与水1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1配比。无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯根际土壤微生物群落的影响

2.2.1 细菌、真菌和放线菌数量

由表2可知：T3处理的细菌数量显著高于对照组，其他处理与对照组无显著差异，各处理细菌数量增幅顺序为T3>T4>T5>T1>T2；T2和T3处理的真菌数量显著低于对照组，降幅分别为10.91%和12.42%，其他处理的真菌数量显著高于对照组；各处理的放线菌数量较对照组都有所提高，T3处理的放线菌数量分别比对照组、T1、T4、T5处理高58.91%、9.56%、6.64%和8.45%。

表2 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯根际土壤细菌、真菌和放线菌数量的影响

2.2.2 自生固氮菌数量

由图2可以看出，各处理组土壤好氧型自生固氮菌数量均显著(<0.05)多于对照组，T1、T3、T5处理间无显著差异，T3处理的好氧型自生固氮菌数量最多，比T2和T4处理分别显著提高35.14%和12.83%(图2-A)；T4处理的厌氧型自生固氮菌数量最多，分别比照组、T1、T2、T3、T5处理高54.80%、61.19%、74.58%、12.21%、14.71%(图2-B)。

图2 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯根际土壤自生固氮菌数量的影响

2.2.3 硝化细菌数量

由图3可知，T4处理硝化细菌数量最多，比T1和T3处理分别高69.62%、29.81%，但与对照组、T2和T5处理差异未达显著水平(>0.05)(图3-A)；T1、T2处理的反硝化细菌数量显著少于对照组，其他处理均显著(<0.05)高于对照组，其中，T4处理的反硝化细菌数量分别比对照组、T3和T5处理高36.78%、15.78%、20.07%(图3-B)。

图3 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯根际土壤硝化细菌数量的影响

2.3 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯产量的影响

由图4可知，马铃薯单株产量随清水苜蓿土壤浸提液比例的增加呈先升高后降低的趋势，T1～T5处理的马铃薯单株产量均显著(<0.05)高于对照组，其中，T4处理产量增幅最大，分别比对照组、T1、T2、T3和T5处理高10.52%、6.59%、5.54%、1.78%和2.81%。

图4 清水苜蓿土壤浸提液对马铃薯产量的影响

3 讨论

土壤环境酶在诱导土壤代谢，参与土壤养分循环、土壤肥力形成和土壤净化等生化过程中发挥着至关重要的作用，且随着连作年限的增加土壤环境酶活性呈下降趋势。有研究显示，苜蓿等豆科植物通过共生固氮作用可以显著提高马铃薯田的土壤环境酶活性，其根系能够增加土壤中的有机氮含量，从而产生积极的环境效应。本试验通过提取苜蓿土壤浸提液浇灌马铃薯种植土壤代替轮作豆科牧草来缓解马铃薯连作障碍，在增加马铃薯种植面积的基础上改善马铃薯的土壤环境，从而对土壤活性产生不同程度直接或间接的影响。

土壤过氧化氢酶通过分解过氧化氢降低其毒害作用，常用作评价土壤质量好坏的生物活性指标。本研究结果表明，清水苜蓿土壤浸提液能提高连作马铃薯土壤过氧化氢酶活性，T3处理促进作用最显著，这与王仪明等的研究结果一致。土壤脲酶活性反映了土壤对无机氮的供给能力和酰胺态氮的转化能力，也间接反映了土壤的生产力和土壤成熟程度，以及肥力水平。蔗糖酶活性强弱反映土壤熟化程度和肥力水平，对增加土壤中营养物质含量起重要作用。本研究中，不同浓度清水苜蓿土壤浸提液对连作马铃薯根际土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性均有显著影响，这可能是因为苜蓿的固氮作用提高了土壤有机质含量，微生物生长和繁殖也随之加快，酶活性增加，这与前人的研究结果一致。T5处理的脲酶活性低于对照组，同黎舒等的研究结果相似，均表明高浓度浸提液抑制了土壤脲酶活性。

土壤碱性磷酸酶通过催化磷酸酯或磷酸酐的水解来释放无机磷酸盐，这些物质可以被植物和微生物吸收，其活性直接影响土壤有机磷的分解、转化和利用。Moulin等研究表明，豆科植物和马铃薯轮作后，对马铃薯根际土壤酶活性有明显的促进作用，本研究结果与此相似，清水苜蓿根际土壤浸提液与水体积比4∶1处理对马铃薯根际土壤酶活性促进效果较好。

土壤微生物是土壤的重要组成部分，其通过分解和参与养分循环在土壤肥力中发挥重要作用。土壤“细菌型”微生物减少、“真菌型”微生物增多被认为是造成连作障碍的主要原因之一。与连作相比，轮作更有利于马铃薯根系生长和对土壤养分的吸收利用，进而促进土壤微生物生长和繁殖。本研究结果表明，T4处理增加了土壤中厌氧型自生固氮菌、硝化菌和反硝化菌的数量，T3处理显著增加了细菌、放线菌和好氧型自生固氮菌的数量，同时有效地减少了真菌数量，这与王劲松等的研究结果一致。T2和T3处理真菌数量均低于对照组，说明豆科植物土壤浸提液对真菌有一定的抑制作用。邹莉等研究表明，大豆连作显著增加了土壤中细菌的数量，减少了真菌数量，本研究结果与此相一致。

连作障碍会严重影响作物的生长，最直接的表现为产量降低，但高产是种植农作物追求的目标之一。本研究中，清水苜蓿土壤浸提液显著提高了马铃薯产量，且随着清水苜蓿土壤浸提液比例的增加马铃薯产量呈先升后降的趋势，可能是清水苜蓿土壤浸提液改善了土壤中的微生物组成及其群落结构，从而促进了植株对土壤养分的吸收能力，进而提高产量。