人脱细胞羊膜在生物医学领域中的应用研究进展

许发亚, 何 琪, 李细艳, 涂 皎, 肖雁冰

(遵义医科大学附属妇幼保健院 妇产科, 贵州 遵义, 563000)

组织工程概念核心是建立细胞与支架材料的复合体，并用于病损部位的组织修复、结构重建和功能恢复[1]。组织工程的顺利实施及应用需要具有以下3个方面的条件: ① 合适的种子细胞; ② 支持细胞黏附和生长的支架材料; ③ 诱导、调控组织增殖分化的生物活性因子[2]。支架材料作为种子细胞的人工细胞外基质，担负了种子细胞生长、繁殖及形成新组织的重要责任，而理想的支架材料应具有以下优点: ① 低免疫原性，在体内无排斥反应; ② 良好的生物相容性，在体内无炎症反应和毒性反应; ③ 分泌细胞生长因子，为种子细胞生长繁殖提供保障; ④ 有三维立体空间结构，表面的微结构有利于细胞的黏附和生长; ⑤ 可塑性，能够适用于不同的周围环境，保持特定的弹性[3]。人脱细胞羊膜支架是经过特定处理后得到的一种具有良好空间结构的天然支架材料[4], 因其具有良好的生物相容性、低免疫原性、三维立体空间结构及取材容易等优良特性而被广大学者所关注，成为组织工程的研究热点。本研究结合相关文献对人脱细胞羊膜支架在生物医学领域应用的研究进展进行综述。

1 人脱细胞羊膜特性

人羊膜是位于胎盘最外层接触羊水的一层膜性组织，无神经及血管，具有丰富的细胞外基质，其大致分为具有人羊膜上皮细胞的上皮层、有大量胶原蛋白的基底膜层、致密层、纤维母细胞层以及海绵层。在应用物理、化学或生物酶制剂进行脱细胞处理时，可去除羊膜的上皮细胞组分，为后续种植上的种子细胞提供更大的三维立体空间结构。人脱细胞羊膜作为一种天然的支架材料，拥有第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ型胶原[5], 同时也具有纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素、弹性蛋白等多种蛋白，上述成分决定了人脱细胞羊膜具有一定的弹性及机械强度[6]。人脱细胞羊膜还具有碱性成纤维细胞因子、透明质酸、转化生长因子等多种有效成分[7], 也可以促进器官或者组织的修复。人新鲜羊膜本身就具有低免疫原性，在对其进行脱细胞处理的同时也会将其致免疫性的细胞成分一并脱下，更进一步降低其免疫原性[8]。将人脱细胞羊膜与牙周膜干细胞(PDLSCs)[9]、脂肪间充质干细胞(AMSCs)[10-11]、骨髓间充质干细胞(BMSCs)[12-13]、人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)[14]等多种间充质干细胞联合培养后，均显示人脱细胞羊膜对多种间充质干细胞有良好的生物相容性，并可分泌多种促进细胞和(或)组织增殖修复的生物活性因子。杨德宇等[11]对人脱细胞羊膜进行的力学拉伸实验证明了其具有良好的弹性、抗拉伸及抗变形的能力，能够满足大部分组织和(或)器官对生物支架的可塑性要求。基于上述人脱细胞羊膜的良好特点，其可作为组织工程中一种新型的生物支架材料。

2 人脱细胞羊膜支架在生物医学领域的应用

近年来，基于人脱细胞羊膜的优良特性，其用于软组织修复、骨损伤重建、皮肤再生、预防粘连等的研究越来越多。人脱细胞羊膜本身具有的促进组织和(或)器官修复的间充质干细胞及生长活性因子含量相对较少，故目前常用作生物支架负载联合其他间充质干细胞协同对组织和(或)进行修复，并表现出广阔的应用前景。

2.1 软组织修复

2.1.1 关节软骨组织工程: 关节软骨主要分布于长骨末端，是一种无神经、无血管的致密结缔组织，主要发挥在运动过程中的减震作用，损伤后治疗不及时将会罹患上骨关节炎、长期慢性疼痛以及导致残疾的概率升高[15]。关节软骨具有缺乏氧气、缺少血液供应的特殊生理结构，这就导致其营养物质的来源十分有限，自我修复的能力较差[16]。目前，临床上重度软骨损伤的治疗方式仍以物理治疗联合手术为主，但治疗效果因人而异，且对家庭经济情况要求较高。优良的细胞支架为种子细胞提供适宜的存活环境，可增强其增殖分化能力并提高细胞利用率。贾海栋等[17]设计实验将人脱细胞羊膜负载BMSCs后植入家兔软骨损伤患处，证实二者除了具有较好的生物相容性外，且促进软骨组织修复的效果优于单独使用支架或细胞治疗，考虑人脱细胞羊膜对关节腔内的干细胞有一定的募集作用，并且可以促进BMSCs在此处的增殖与分化，因此可以促进软骨组织的修复。ZHANG J等[18]也将人脱细胞羊膜联合hAMSCs植入兔软骨损伤处，结果也证实了联合使用细胞及支架组较单独使用细胞组的治疗效果更显著。因此，人脱细胞羊膜能够增加细胞的黏附和增殖分化，在周围环境不理想的情况下为干细胞的治疗效果提供环境支持，为组织工程在相对特殊生理结构的组织治疗中提供了新的思路。

2.1.2 心脏组织工程: 心肌梗死是目前发病率及病死率较高的一种疾病[19]。目前心肌梗死的治疗局限性在于只能改善发病后的情况，并不能恢复梗死的心肌细胞的功能，而唯一的治疗方式则是心脏移植，这就意味着需要面临供体不足和移植后强大的排斥反应的情况，显然这并不是一种很理想的治疗方式。为了解决这一困难, BLUME G G等[20]将人脱细胞羊膜用可吸收缝合线置于心肌梗死大鼠左心室壁，并在30 d后对大鼠进行观察，结果显示实验大鼠左心室射血分数有显著恢复，心肌细胞及血管组织在病损处再生。人脱细胞羊膜支架能够恢复心肌细胞生理功能，可以为运输其他治疗因子提供机械支持，为心血管疾病治疗提供了新的治疗手段。

2.1.3 气管尿道重建: 气管狭窄是气管插管或气管切开术后引起的严重并发症[21], 后期形成的瘢痕及纤维化在行手术治疗切除后会造成较大面积的气管缺损，当缺损长度超过断端吻合极限的时候，则需要考虑人工合成气管来代替。理想的气管替代物需要拥有良好的生物相容性以及适当的降解率，最好可以促进细胞黏附和增殖分化[22]。BAGGIO SIMEONI P R等[23]利用人脱细胞羊膜负载人脐带间充质干细胞(hUMSCs)置于兔气管缺损模型处, 2个月后观察发现气管缺损处修复效果较对照组显著提高。尿道的先天畸形、手术创伤、外伤等可能会导致尿道狭窄，长度较大的尿道狭窄段切除后无法进行断端吻合术，而传统尿道修复材料如自体小肠黏膜下层、口腔黏膜、颊黏膜等，因供体组织材料不足且术后供体部位极易发生神经损伤、瘢痕、挛缩等并发症，这种牺牲自我组织替代新组织的方法并不是临床治疗所鼓励的。ZHANG D L等[24]利用人脱细胞羊膜负载皮肤上皮细胞用于兔尿道缺损修补，术后发现新尿道上皮黏膜光滑平整，新生血管丰富，而且新尿道尿流速率与正常尿道相同，功能性较正常尿道无明显差异，据此认为采用人脱细胞羊膜替代组织材料修复尿道缺损这一方法是可行的。张鑫等[25]对犬尿道造成3 cm的缺损，而后利用人脱细胞羊膜负载BMSCs和血管内皮祖细胞后缝合于尿道缺损处，术后新生尿道的管壁光滑、无狭窄，未见明显瘢痕形成，排尿也正常，证明采用脱细胞羊膜支架对尿道缺损有良好的修复效果，或可作为一种新的尿道替代材料用于修复尿道缺损。

2.2 骨缺损组织工程

在骨损伤中，原始骨组织的愈合及新生骨的形成和成熟是一个相当漫长的过程，目前的骨缺损修补技术已有很多，包括自体骨移植、异体骨移植、异种骨移植、骨延长术和骨膜诱导术等[26], 但这些方法的主要缺点是供体骨来源有限、患者疼痛加重、生物材料疗效不确定、愈合周期过长、治疗费用高等。骨膜具有多种间充质干细胞及成骨细胞，手术后去除部分骨膜会严重影响骨组织的正常恢复，而目前构建组织工程骨膜也是治疗骨缺损的一种重要的治疗方式。肖正俊等[27]采用人脱细胞羊膜与BMSCs构建组织工程骨膜，在进行诱导分化后在电镜下观察有大量成骨组织生成，可置于骨缺损处诱导成骨组织的生长。TANG K等[7]研究表明人脱细胞羊膜增加了骨形成和骨重塑，并且可以影响BMSCs、破骨细胞、成骨细胞等的募集和活化，从而促进骨再生，考虑与细胞募集和骨重塑有关的趋化性细胞受体因子-4(CXCR-4)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、OC和组织蛋白酶K(CatK)的基因表达在植入的缺损处增强而治疗骨缺损有关。人脱细胞羊膜具有与骨膜相同的特点，可以提供给缺损骨组织营养物质，生成机械屏障，同时能刺激细胞的募集和活化，刺激成骨细胞的生成，从而促进骨组织的修复。

2.3 皮肤再生

皮肤被认为是人体最重要的器官之一，具有重要的功能，不仅可以抵御各种外界的有害物质的侵入，维持内环境的稳定，而且可以调节机体温度[28]。竺亚斌等[29]将人脱细胞羊膜覆盖在背部皮肤全层损伤大鼠模型上，外侧用无菌纱布包裹, 3周后使用人脱细胞羊膜的大鼠皮肤已基本愈合，且愈合程度显著优于普通治疗组，考虑人脱细胞羊膜对皮肤损伤具有较好的治疗效果。重度烧伤患者主要的治疗方式是植皮[30]，其中包括自体皮肤移植和异体皮肤移植，但无论是哪种方法，患者都是要承受巨大的经济压力和痛苦。KITALA D等[31]采用人脱细胞羊膜治疗1例重度烧伤患者, 12 d后该患者痊愈出院，相较于同期进行异体皮肤移植患者的住院周期显著缩短，患者术后亦无排斥现象，也没有疼痛、过敏以及伤口感染的情况。对于皮肤创口而言，人脱细胞羊膜支架不仅属于种子细胞的细胞外基质，同样也可作为伤口的敷料用于减少感染和治疗。

糖尿病患者因自身疾病的原因，产生的伤口很长时间不能恢复，后期极易发生感染、坏死等可能，糖尿病伤口已严重影响到患者的日常生活及心理状况[32]。除了首要控制血糖以外，伤口的手术清创和外用移植物也是糖尿病伤口的治疗方式之一。XIAO S E等[33]将已分离出的AMSCs外泌体种植于人脱细胞羊膜支架上，然后置于糖尿病动物模型的伤口处，结果表明AMSCs外泌体联合人脱细胞羊膜支架可以调节伤口部位的炎性免疫因子、促进周围血管增殖和促进细胞外基质的产生来加速伤口的愈合，人脱细胞羊膜支架联合干细胞外泌体在此方面展现出了巨大的治疗潜力。下肢静脉性溃疡是深静脉瓣关闭不全导致静脉回流障碍，静脉压升高导致下肢皮肤破损，易在同一区域反复发作，并会导致破溃感染、长期慢性疼痛、下肢皮肤色素沉着、硬化甚至恶变的可能。WU Z P等[34]在临床上经过患者知情同意后将人脱细胞羊膜直接放在患者静脉溃疡处用无菌纱布包裹，结果表明仅2周时间溃疡面积显著缩小，患者疼痛感显著好转，溃疡周围炎性渗出物及新生肉芽肿也显著减少，且治疗完成后患者未出现炎症及过敏反应，治疗费用也远低于普通治疗方案。

在皮肤再生的治疗中，人脱细胞羊膜具有丰富的胶原，可以促进皮肤上皮细胞的再生，也可以作为生物支架为种子细胞提供生长繁殖的细胞外基质，还可以作为抗菌消炎的机械屏障，在治疗过程中使用方法简便、易于移植，无任何不良反应，也不用担心其降解率的问题。

2.4 预防粘连

肌腱粘连会导致肢体运动受限，严重影响患者后期的生活质量，临床上多运用加强手术缝合方式、加用防粘连物质及其他人工合成材料等减轻术后肌腱粘连情况[35], 但效果都不尽如人意，且人工合成生物材料存在排斥反应大、低降解率等缺点。白江博等[36]考虑用低免疫原性的人脱细胞羊膜降低移植后的排斥反应，因良好的降解率也无需二次手术，在对肌腱损伤的动物模型中运用人新鲜羊膜及人脱细胞羊膜后表明二者均可预防肌腱粘连，结果证明因人新鲜羊膜有间充质干细胞，较人脱细胞羊膜有更好的预防肌腱粘连的效果。冯勇等[37]通过比较人脱细胞羊膜、药物及生长因子对预防肌腱粘连的作用，认为人脱细胞羊膜除了在治疗肌腱损伤方面可以起到屏障作用，在早期预防肌腱粘连方面也有不错的疗效，因其具有活性的细胞已被去除，后期加之使用具有分化能力的干细胞，将是预防肌腱粘连的新方向。

运用干细胞治疗宫腔粘连是许多学者共同研究的目标，但干细胞不能在受损的宫腔部位长期存活，使之不能达到应有的治疗效果[38]。常用的宫腔支架主要是宫内节育器、球囊支架以及透明质酸等[39], 但因其具有压迫内膜、引起感染、在宫腔内存活时间短、对干细胞的生长无促进作用等问题，并非是理想的宫腔支架材料。HAN X等[40]将AMSCs联合人脱细胞羊膜支架放入宫腔粘连大鼠模型宫腔内，术后观察大鼠子宫血管生成因子上升, CD34免疫组化及免疫荧光表达均上升，考虑联合移植物是通过促进血管生成增加子宫内膜血流量，从而修复失去功能的内膜基底层。CHEN X等[41]将人脱细胞羊膜支架放入大鼠宫腔粘连的模型中，结果显示该支架通过抑制结缔组织生长因子和下调基质金属蛋白酶-2抑制剂的表达而发挥抑制子宫内膜纤维化的作用。人脱细胞羊膜良好的可塑性及机械弹性将成为未来治疗宫腔疾病的新型常用支架材料。

3 总结与展望

人脱细胞羊膜支架具有独特优点: ① 人脱细胞羊膜支架是一种天然支架，取材简便且无伦理争议，无细胞毒性，具有多种生物活性因子，更有利于种子细胞的黏附及生长繁殖，能在受损部位有较长的存在时间。② 人脱细胞羊膜可由使用者随意选取所需要的大小，放入别的支架所不能置入的部位。③ 人新鲜羊膜具有低免疫原性，在经过脱细胞处理后免疫成分再次被脱去，使之免疫原性更低，在动物或人体上几乎无排斥反应，这都是其他生物支架所不能比拟的。

就临床安全性而言，特别是作为伤口敷料这一方面，人脱细胞羊膜已被国家批准用于治疗临床的烧伤及创面缺损治疗(国械注准20153462192)，其安全性尚无明显的争议。此外，人脱细胞羊膜来源广泛，制备及储存条件相对简便，治疗费用也大大降低，在软组织修复、骨组织再生、皮肤再生及预防组织粘连等方面具有广阔的应用前景，是组织工程学的理想候选支架材料。