不同炮制方法对黄药子抗胃癌作用及其肝毒性的影响*

王 灿 梁 枫 刘学医 周逢仓 吕向阳 胡 霞

(安徽中医药高等专科学校，芜湖 241000)

黄药子，别名黄药、黄药根，系薯蓣科植物黄独(DioscoreabulbiferaL.)的干燥块茎，可凉血、降火、消瘿、解毒，临床可用于食道癌、胃癌的治疗[1-2]。虽疗效突出，但因肝毒性，制约了其在临床广泛应用[3]。要充分发挥其疗效价值，势必要对其进行减毒。

炮制为中药独特加工处理技术，通过一定制法使药材改性或增效、应用安全[4]。目前对黄药子的炮制研究较为匮乏，未见不同炮制方法对黄药子抗肿瘤作用影响的报道。本研究拟通过体内外实验评价不同炮制方法对黄药子的减毒增效作用，除既往已有一定研究的当归之外，尝试使用在诸多方剂与配伍中应用广泛、疗效确切且不良反应少的黄芪，结合临床常用的炒制、酒剂使用的现状，比较当归制、黄芪制、酒制、炒制等炮制方法对黄药子抗胃癌作用及肝毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物和试剂 黄药子(产地河南，批号200901)，黄芪(产地甘肃，批号210301)，当归(产地甘肃，批号20091104)，经安徽中医药高等专科学校药学系王宁教授鉴定;CCK-8试剂盒(HY-K0301，MedChemExpress公司);MKN-45细胞专用培养基(CM-0292，武汉普诺赛生命科技有限公司);胎牛血清(Biosharp BL201A)、胰蛋白酶(Biosharp BL512A)、磷酸缓冲盐溶液PBS(Biosharp BL302A)(北京兰杰柯科技有限公司)。

1.1.2仪器 BGL-50GB远红外干燥箱(上海本亭仪器有限公司);R-1020旋转蒸发器(河南省巩义市宏华仪器设备有限公司);GN-36高速中药粉碎机(杭州旭众机械设备有限公司);全波长酶标仪(英国安图斯Zenyth 200);HH-US-B水浴箱(上海赫田科学仪器有限公司);5810R型低温离心机(日本HITACHI);2135型切片机(德国莱卡);Moticam5000显微摄影成像系统(美国);DRP-9272电热恒温箱(上海森信实验仪器有限公司);Thermo Scientific Evolution 360 Bio紫外分光光度仪(美国);KRD-LB3型石蜡包埋机(湖北省孝感康瑞德科技有限公司);KH-P2恒温摊烤片机(湖北省孝感阔海科技有限公司);XE805S电子分析天平(天津市德安特传感技术有限公司)。

1.1.3细胞株 人胃癌细胞MKN-45(Procell CL-0292,武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.1.4动物 ICR小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(20±2)g(动物许可证号：SCXK(苏)2012-0009)，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。置动物饲养笼内，于实验前适应性饲养1周，室内按自然昼夜节律明暗交替照明，保持室温18℃～22℃，湿度60%～80%，标准小鼠饲料喂养。所有动物实验符合动物伦理学要求。

1.2 方法

1.2.1黄药子炮制品及各组提取物的制备 参考《中国药典》2020年版[4]4部0213炮制通则中炮炙项下单炒(清炒)法、炙法项下酒炙法及一部黄连项下萸黄连炮制方法分别制备清炒黄药子(FD)炮制品、酒炙黄药子(WD)炮制品和当归煎汤炙黄药子(2∶1)(ASR2∶1DB)、黄芪煎汤炙黄药子(1∶2)(AR1∶2DB)、黄芪煎汤炙黄药子(1∶1)(AR1∶1DB)、黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)(AR2∶1DB)炮制品。

分别称取黄药子生品(RD)、FD、WD、ASR2∶1DB、AR1∶2DB、AR1∶1DB、AR2∶1DB各20g，使用95%乙醇为溶剂，采用传统回流提取法分别得黄药子生品及各炮制品醇提物，得率依次为15.21%、14.79%、12.36%、13.65%、13.87%、12.91% 和13.42%。4℃储存备用。

1.2.2动物分组及给药 ICR小鼠80只随机分为空白对照(Ct)组、黄药子生品(RD)组、清炒黄药子(FD)组、酒炙黄药子(WD)组、当归煎汤炙黄药子(2∶1)(ASR2∶1DB)组、黄芪煎汤炙黄药子(1∶2)(AR1∶2DB)组、黄芪煎汤炙黄药子(1∶1)(AR1∶1DB)组、黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)(AR2∶1DB)组，每组各10只，均雌雄各半，每只称重并记录。采用灌胃分别给予各组对应炮制药物，1次/d，连续14d。按照临床成人每日单次剂量等效换算为小鼠剂量，RD及其它各炮制组以生药计均为1.7g·kg-1[5]，Ct组给予生理盐水。给药期间正常喂养，环境温、湿度及光照等条件同前保持稳定。

1.2.3取材及样本制备 各组连续给药14d后，于取材前一晚8点禁食不禁水，次日上午各组小鼠称重，腹腔内注射0.1%戊巴比妥钠麻醉(用量0.001ml/g按体重计算),迅速打开腹腔，腹主动脉采血，采血后处死小鼠，随即取各组肝脏。

1)血液处理。经室温静置2h，离心(4℃，3500r/min，15min)，取上清液，除菌处理后-80 ℃冷冻贮存。

2)肝脏处理。冰冷生理盐水洗净,滤纸吸干表面液体，称重。

3)肝组织病理固定。取适量肝脏组织切成0.5～1cm3大小，常规固定于4%多聚甲醛溶液中，HE染色，石蜡制片。

1.2.4细胞培养及CCK-8法检测细胞增殖 按照CCK-8试剂盒说明书方法操作：将人胃癌细胞MKN-45接种于培养皿中，放置细胞培养箱中37℃及5%CO2条件下于MKN-45细胞专用培养基中培养，当细胞贴壁达85%时按1∶3传代，取对数生长期细胞制成单细胞悬液，并调整密度为5×104个/mL，96孔板接种细胞悬液，每组6复孔，每孔接种量100μL，各组每孔分别加入对应血清10μL，于加入血清后即刻(0h)以及培养24、48、72h后，分别加入CCK-8试剂10μL，37℃及5%CO2孵育2h后，使用酶标仪测定各组吸光度(测定波长为450nm)，以0h所测得每组吸光度值作为基线，计算细胞数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组药物对人胃癌细胞MKN-45增殖的影响

各组炮制药物均能够对人胃癌细胞MKN-45的增殖产生抑制作用，且逐渐有所增强，以AR1∶1DB、AR2∶1DB、ASR2∶1DB组作用明显。与Ct组比较，24h、48h、72h时AR1∶1DB、ASR2∶1DB组均有差异(P<0.05)，AR2∶1DB组具有差异(P<0.001)；与RD组比较，24h、48h、72h时AR1∶1DB、ASR2∶1DB组均有差异(P<0.05)，AR2∶1DB组具有差异(P<0.001)；24h时AR1∶1DB、AR2∶1DB、ASR2∶1DB三组细胞数量变化显著，与AR1∶1DB组比较AR2∶1DB组有差异(P<0.05)，与ASR2∶1DB组比较AR2∶1DB组有差异(P<0.05)；48h与72h比较此三组细胞数量变化相对较小，48h时与AR1∶1DB组和ASR2∶1DB组比较AR2∶1DB组均有差异(P<0.05)；72h时AR2∶1DB组和AR1∶1DB组相比有差异(P<0.05)，和ASR2∶1DB组相比有差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组24、48和72h人胃癌细胞MKN-45数量

2.2 各组小鼠肝脏组织病理形态学

Ct组肝小叶结构完整、清晰，肝细胞排列整齐，各组织学结构正常。AR2∶1DB组肝小叶结构完整，肝血窦清晰，肝索排列较整齐，肝细胞核清晰可见，与Ct组相比无明显差异。ASR2∶1DB组肝小叶结构较为完整，肝细胞轻度水肿，细胞间隙内见有少量胆汁淤积，中央静脉内轻度淤血。AR1∶1DB组肝小叶结构尚存，内有少量淤血，肝细胞中度水肿，细胞肿胀，胞质疏松内有较多颗粒，坏死不明显。AR1∶2DB组肝小叶正常结构消失，中央静脉内见少量淤血，肝细胞轻度脂肪样变性，呈气球样变，门管区周围肝细胞见少量局灶性坏死。FD组肝小叶正常结构消失，肝细胞排列紊乱，呈明显水肿，以气球样变性，间隙内有少量淤血，门管区周围肝细胞呈多灶性坏死伴有肝细胞再生，有少量淋巴细胞浸润。WD组肝小叶正常结构消失，肝细胞排列紊乱，呈重度水肿，胞质疏松呈空网状，门管区周围肝细胞见明显片状坏死灶伴有肝细胞再生，有少量淋巴细胞浸润。RD组肝小叶正常结构消失，肝细胞排列紊乱，呈明显水肿，以气球样变性，门管区周围肝细胞可见多个片状坏死灶伴有大量炎性细胞浸润。见图1。

注：A.Ct组;B.AR2∶1DB组;C.ASR2∶1DB组;D.AR1∶1DB组；E.AR1∶2DB组；F.FD组；G.WD组；H.RD组

3 讨论

传统中药黄药子药用价值较高，现代临床常用来治疗胃癌等消化道肿瘤，但其毒性较大，临床报道多集中于肝损害方面。中药配伍减毒历史悠久，炮制则更是增强药效之传统中医药独特技术。本实验通过结合黄药子炮制与探索不同药物与之配伍的方法以考察使黄药子增效减毒的有效措施，进一步提升其应用的安全性和有效性。本实验结果表明黄药子生品在抑制胃癌细胞增殖的同时也造成了肝脏损害，表现出明显的肝毒性，而其它各炮制品的减毒增效作用表现则各不相同，具体如下：1)清炒法、酒炙法和黄芪煎汤炙黄药子(1∶2)炮制法均有不同程度的改善肝脏组织病理改变作用，但在抑制胃癌细胞增殖方面效果均并不理想，即此3组可对黄药子有一定减毒作用，但未有增效。2)黄芪煎汤炙黄药子(1∶1)、黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)和当归煎汤炙黄药子(2∶1)炮制法：此3组在增强黄药子的抗胃癌作用同时也保护了肝脏，降低其肝毒性，减毒增效作用显著。其中以黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)法作用最强，黄芪煎汤炙黄药子(1∶1)法和当归煎汤炙黄药子(2∶1)法则作用相当。

黄芪作为常用传统中药,具有固表止汗，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效,用于气虚乏力，中气下陷，血虚萎黄，痈疽难溃，久溃不敛等症状[4]，见于诸多以抗肿瘤为目的的中药复方[6]。但是有关黄芪配伍炮制黄药子以减毒增效的实验研究还未有报道，因此本实验设置黄芪煎汤炙法炮制黄药子的考察组且分为1∶1、2∶1、1∶2 3种配伍比例，旨在考察黄芪对黄药子的炮制增效减毒作用表现。结果表明此炮制法增强了黄药子抗胃癌作用同时减少了其对肝脏的损害，且药效随着黄芪在药对中所占的比重增大而增强，以2∶1组最为突出。究其可能原因，有研究报道显示黄药子能抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡[7]，而黄芪中的多糖类成分不仅通过调节下游基因的转录影响细胞生长周期从而抑制胃癌细胞增殖，而且可促进免疫细胞增生、提升机体免疫能力，激活肿瘤细胞免疫应答，调动免疫系统发挥抑制肿瘤的作用[2，8]。因此，黄芪可能与黄药子经炮制后产生协同作用从而使其抗胃癌效应增强。此外，黄药子对机体肝脏的损害程度与剂量呈线性关系，其毒性产生的机制可能与谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性受抑制以及氧化应激所致自由基损伤有关[9]。黄芪性味甘，归肺、脾经，甘缓减毒，其抗氧化有效成分黄芪多糖可抑制细胞氧化损伤、刺激抗体产生、清除自由基，还可通过启动谷胱甘肽过氧化物酶等解毒酶系以保护肝细胞[8]而起到减毒作用。黄芪的这种炮制增效减毒作用与其用量的多少成正比，其内在物质基础和深入机制有待于进一步研究。

近年来当归配伍黄药子进行减毒研究的报道较多，显示当归与黄药子比例为2∶1时减毒效果最为理想[3,9-10]，故本实验将其纳入作为验证对比。现有研究认为当归配伍黄药子可使其主要毒性成分黄独乙素和儿茶素的质量分数下降，能够拮抗肝细胞内grp78基因表达上调并逆转黄药子对肝脏生物氧化酶和药物代谢酶活性的抑制[11-12]，这可能是当归对黄药子起减毒增效作用的机制。本实验明确当归煎汤炙黄药子(2∶1)炮制法具有良好减毒增效作用，但并未优于黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)炮制法，关于此两种方法的效用差别其炮制物质基础及内在机制仍需后续深入研究确定。

本实验同时考察了临床常用的清炒炮制法与酒炙炮制法对黄药子药效及毒性的影响，结果显示此二法仅有部分减毒效果而增效作用不明显。推测对黄药子炒制加热或酒制的过程可能并未从根本上改变其主要化学活性成分和作用，尚需更多相关实验指标检测加以验证。

本实验研究不同炮制方法对黄药子抗胃癌作用及其肝毒性的影响，并首次尝试将黄药子与黄芪配伍使用，证实了黄芪煎汤炙法和当归煎汤炙法均可对黄药子起到减毒增效作用，且黄芪煎汤炙黄药子(2∶1)炮制法效果最佳，一定程度上为中药减毒配伍研究提供了新的思路。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。