中药药用活性成分的生物合成研究进展

李清清 刘志斋张洁 徐德林∗

（1.遵义医科大学， 贵州 遵义563099； 2.西南大学农学与生物科技学院， 重庆400715； 3.四川省农业科学院生物技术核技术研究所， 四川 成都610061）

中医药是我国的瑰宝，在我国数千年的历史长河中对人类的健康有着决定性作用。中药防治和干预疾病时发挥作用的物质基础就是药用植物中的药用活性成分，这些活性成分主要包括生物碱类、甾体类、多酚类、萜类等，是植物进行次生代谢产生的复杂化合物，也是中药治疗疾病的根本。在植物细胞、组织等的分化与完善过程中，这些次生代谢产物在特定的部位逐渐积累，但是总含量较低，因而入药部位少，药用成本高。采用化学法合成植物的复杂次生代谢产物，存在合成步骤繁琐、合成成本高、环境不友好等缺点，使得药用植物生物活性成分无法大量人工合成。而合成生物学方法具有高效、经济、稳定、绿色环保、周期短等优点，是现代新药的创新途径，具有独特的优势和发展潜力。合成生物学的发展为药用植物活性成分的研究注入新的动力，对于药用植物活性成分的生物合成研究也取得了巨大进展，本文对药用植物活性成分在合成生物学上的研究进展做概括介绍，以期为进一步研究提供理论依据。

1 中药药用活性成分

药用植物的治疗潜力是由于其存在一些生物活性成分，如单宁、萜类、生物碱、类黄酮等小分子化合物。单宁具有收敛、消炎、止泻、抗氧化、抗菌等生理活性，可加速伤口和发炎黏膜的愈合。萜类化合物存在多种类别，有单萜、二萜、倍半萜等，大多具有清除自由基、消除炎症、防治肿瘤、降血糖、抗胆碱酶等活性，对预防和治疗癌症、减少炎症发生、治疗呼吸道疾病、治疗糖尿病等都有重要价值。生物碱具有防治疟疾、哮喘、癌症、心律失常、高血糖、镇痛等作用，在传统和现代医学中广泛使用，亦可作为药物发现的起点。有些生物碱还是兴奋剂类精神活性药物，可用于创伤治疗。类黄酮也具有抑菌、抗病毒、防治癌症、清除自由基、延缓衰老、预防心血管疾病、止痛、镇痛等作用。

中药起作用的根本保证是药用活性成分，这些活性成分也是开发新药的源头［1⁃2］。药用活性成分结构复杂、含量少，化学方法合成难度大，甚至会破坏生态环境，而且许多中药材的生长还受土壤、季节等生态环境因素限制，部分珍稀中药材的生长周期长，其活性成分更是无法大量获取，科研和新药的大量需求是传统提取方法或化学合成法无法满足的，合成生物学方法将有效解决这一矛盾［3］。

2 合成生物学应用于药用活性成分富集的研究概况

合成生物学是21 世纪新兴的一门学科，是在基因工程、代谢工程等学科的基础上形成的整合学科。合成生物学以生物学为基础，融入工程学的模块化与系统设计理念，以达到人工改造并优化生物合成过程中有关的生物元件，或者合成全新的具有定向性能的新生物体的元件、器件或模块，设计更加系统稳定的生物体系的目的。由此形成的合成生物体系将在能源、医学、材料、环境、天然化合物等领域达到规模化应用。合成生物学是生命发展过程中人类第1 次将生命科学工程化的学科［4］。合成生物学的内容包括合成生物学系统的设计与组装、调控与优化，在生物合成系统设计上主要包括底盘细胞的选择、合成生物系统所需元件和途径挖掘、计算机辅助的设计与分析、生物合成系统的构建与组装等方面。系统的调控优化主要是在基因组水平上的全局优化以及单点的调控与优化，系统优化包括单一基因的优化、多基因途径的组合优化、基因组简化和重构、生物合成系统的分析与筛选、“设计→构建→检验→重设计”的特征循环等方面。

生物合成是生物体内同化反应的总称，具有不同的生理意义，包括①提供生物体生长发育和繁殖所必要的物质；②在正常状态下，对消耗掉的物质进行补充；③为长期和短期的贮藏进行必要的合成。生物合成有由主要原料进行从头合成的全合成途径（如光合作用等），也有可逆性的废物利用途径，由部分分解产物合成（如嘌呤核苷酸的转换）。生物合成的各个途径之间可能存在相互作用，在生物体中受到复杂的调控［5］。

生物合成通过标准化的生物模块，构建起具有详细生物学特征的元件后转入底盘细胞，通过重新构建代谢合成途径，实现定向高效的异源合成，使代谢工程的改造效率大幅提高，亦可使生物学系统变得更加丰富［6］，具有标准性、简便性的特点。合成生物学策略主要有4种，分别为①表达目标产物，即通过微生物宿主使目标产物的基因实现异源表达；②改进生物合成途径，即将新的生物元件或基因引进生物合成途径，重新组织构建或延伸原有的生物合成途径；③杂合生物合成途径在合适的底盘细胞中的表达；④人工设计构建目标化合物的基因，在合适的底盘细胞中完成基因的表达［7］。底盘细胞即人为在细胞中构建生物系统，使其具有特定功能的细胞，如大肠杆菌、烟草细胞等一些微生物和植物细胞。

基于合成生物学的特点，天然产物尤其是有明确药理活性的单体化合物的研究，在合成生物学出现后获得了全新的机遇。中药药用活性成分的大量获取在极大程度上可依赖合成生物学，其在药用活性成分生物合成中的操作包括选择优良的底盘细胞并对其进行改造（如敲除细胞中的冗余基因、将基因组整合到底盘细胞中人为组装构建新的目标产物合成途径、对合成代谢网络进行调控、通过宿主细胞构建异源合成途径等），进行系统优化并结合发酵工程技术，实现药用活性成分的定向高效合成（如青蒿素的微生物细胞工厂生产等）［8］。目前，许多研究已经通过DNA 重组技术顺利构建拥有高附加值的微生物工程菌株，包括紫杉醇前 体［9］、丹参酮［10］、人参皂苷［11］、阿 片类［12］、姜黄素［13］、鼠尾草酸［14］等化合物。形成一套药用植物合成生物学研究策略［15］，实现目标化合物的高效生产，从而满足人们对药用植物资源中活性成分的大量需求，这将对药用植物资源的可持续利用，提升我国研发创新性药物的能力和国际医药产业的核心竞争力都有很大帮助。

3 中药药用活性成分生物合成中的关键技术

3.1 基因元件的设计改造 基因元件是具备特定功能的核苷酸序列，是生物体中最基本、最简单的单元，包含启动子、增强子、功能蛋白、酶编码基因等，对基因的表达调控有非常重要的意义。这些元件在天然生物中分离得到后，经过人工组合、完善、优化后可得到新的生物元件。李雷等［16］通过易错PCR 法对启动子进行突变，结合基因改组的蛋白工程技术，改造酿酒酵母的TEFl 启动子，建立突变启动子库，得到一系列强度不同的突变启动子。简单的生物元件还可以通过多种多样的组合，在更大规模的设计中形成复杂的具有特定功能的生物元件和装置。例如将效应结构域、RNA 发卡结构和单链RNA 结合蛋白进行组合获得新的功能元件，实现对基因功能的调控［17］。通过基因编辑技术对生物体中基因元件进行精确的修改编辑，也可获得具有新功能的生物元件，例如锌指核酸酶（ZFN），即为工程化体内具有DNA 序列结合特异性锌指蛋白结构域和核酸内切酶FokⅠ结构域构建新的可识别特异序列的核酸酶［18］，而现在只有丹参酮［19⁃21］、紫杉醇［22⁃23］、青 蒿素［24⁃25］、人参皂苷［26⁃27］等少部分药用活性成分的代谢通路研究比较透彻，大多数药物活性成分的代谢途径还在研究和发现中，随着中药药用活性成分相关途径的不断解析，应用于合成生物学的基因元件也将得到补充。因此，目前研究的重要任务之一是对相关生物合成途径的解析以及基因调控元件的发掘。

3.2 底盘细胞的选择和改造 合成生物学可以使底盘细胞具有人类需要的特定生物功能，这些底盘细胞除了要具备自我复制和代谢能力，还应具备生长周期短、遗传背景清晰、易于培养、能通过人工设计调控元件优化原有代谢网络提升合成效率等特征。近年来，大肠杆菌、蓝细菌、酿酒酵母、烟草细胞等微生物和一些植物被广泛用作异源合成的底盘细胞，实现目标产物的高效合成以及某些特定类型的化合物合成，如以酵母为底盘细胞异源合成丹参酮［10］、以烟草细胞为底盘合成青蒿素［28］。

一般来说，底盘细胞本身不能进行繁复的次生代谢，必须对相应底盘细胞的代谢网络施行优化，才能实现目标产物的异源合成。为了解除合成途径中的某些制约，增加目标产物合成效率，有2 种策略可以对合成代谢网络进行改造优化，一种优化方式是“自上而下”地从头合成基因，另一种方式是“自下而上”地逐步敲除冗余基因［29］。

构建异源合成系统的过程中，异源合成途径时常会导致某些有毒中间物的积累，制约合成产物的输送，使代谢途径中能量流动不均匀，目标产物合成过程中没有适合的前体供给，严重扰乱底盘细胞原有的生命活动。因此，底盘细胞的优化关键在于分配好目标产物合成过程中的物质、信息和能量，实现产物合成和运输的优化。随着组学技术的发展，酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等物种的全基因代谢网络模型［30］被建立，通过代谢网络通量分析的方法模拟预测底盘细胞的代谢网络，进而使目标产物的合成得到优化［31］。对底盘细胞基因组的改造赋予了细胞工厂全新的生物学功能和发展前景，如大肠杆菌等基因组的人为重建和优化［29］，不仅对基因组的结构、功能、相互作用等研究有了新的认识，也为构建复杂天然化合物的细胞工厂提供指导，从而选择最佳的底盘细胞代谢合成途径，实现目标产物的合成优化。

3.3 代谢途径的构建策略 生物体代谢途径是由酶催化的复杂动态平衡网络，中药合成生物学中有2 种构建代谢途径的策略用于合成药用活性成分。一种是在已经阐明的生物合成代谢途径上，对原本存在的代谢途径进行重新构建和工程化，这又可以分为3 个层次［32］，分别为①通过底盘细胞本身的前体供应途径，应用基因工程技术生成目标产物；②通过模块化的设计理念和基因工程原理，定向改造并优化合成路径，结合底物调控模块使目标产物高效合成；③对代谢网络的调控，通过可拆卸的基因调控元件构建不同的活性模块，优化模块中的元件［33］，组装形成不同的代谢调控网络［34］，将复杂的生物合成途径变得工程化。另一种策略是设计构建一条全新的药用活性成分合成途径，根据目标物的化学结构从基因数据库中将相应酶基因筛选出来，人为改造并导入底盘细胞，可在底盘细胞中程序化形成一条新的异源代谢途径。

3.4 生物合成工艺的优化 目标化合物的代谢途径并不是一成不变的，而是相互交错而成的动态平衡网络，需要在已有代谢途径的基础上整体进行改进与创新，提高目标产物的合成率，这可从3 个方面进行［32］，分别为①优化生物合成路线，提高工程菌株生物合成途径的效率，方法包括增加前体的供应、增加生物合成路径所需底物的绝对总量以及提高药用活性成分合成的特定途径中的单个基因的表达效率和途径酶的工作效率；②减少或限制竞争代谢途径流入，使相对多的底物进入药用活性成分合成的特异代谢途径；③生物合成代谢网络的整体调控，主要方法是结合生物信息分析，以一种系统的观点对合成途径中的调控进行数学描述，反应代谢网络中的控制，如代谢流控制分析、代谢流量优化等。中药药用活性成分对细胞大多都有一定的毒性，对细胞进行全转录调控可以有效提高细胞性能［35］，增加产物对细胞的耐受性，有利于整个代谢网络的协调，同时增加药用活性成分的生物合成。

4 常用药用活性成分的生物合成研究概况

中药活性成分多属于植物次生代谢产物，类型较多，有4 条主干合成途径，分别为莽草酸途径、氨基酸途径、乙酸⁃丙二酸途径（AA⁃MA 途径）、甲戊二羟酸途径（或称贾瓦龙酸途径，MVA 途径）。

4.1 生物碱的生物合成 生物碱是生物体内次级代谢产生的一大类复杂的含氮有机化合物，主要有多烃类、莨菪烷类、嘌呤类、托品烷类等多种结构类别，其中托品烷生物碱具备抗胆碱等多种生物活性，主要是茄科、毛茛科等双子叶类高等植物次级代谢产生的一类复杂化合物，具有悠久的药用历史。植物中腐胺是托品烷生物碱合成的前体，以鸟氨酸或精氨酸开始，经过相应酶的催化最终合成腐胺，这2 条腐胺的生物合成途径已经得到阐明［36］。这2 条途径在不同植物中对产物合成的贡献不同，但其合成的次生代谢产物都具有物种特异性。托品烷生物碱的生物合成途径也已有部分得到解析，N⁃甲基⁃腐胺转移酶（PMT）是托品烷生物碱合成途径中起作用的第一个酶，其是否为限速酶与物种有关。经N⁃甲基腐胺氧化酶（MPO）催化最终可形成在各代谢途径中发挥中心作用的活性N⁃甲基⁃△1⁃吡咯啉正离子，可以在植物体中参与一些反应生成托品酮，它是合成莨菪碱的前体，也是托品烷生物碱途径特有的二环结构。托品酮还原酶分为托品酮还原酶Ⅰ、托品酮还原酶Ⅱ，它们的酶活性可以直接影响托品烷生物碱的含量，也可以通过影响底物托品酮含量间接地影响托品烷生物碱的含量，这2 种托品酮还原酶的酶活性还会使代谢流的走向受到调控［37］。生物体内存在的其他代谢途径也会调控托品烷生物碱的生物合成，人为对相关信号途径进行设计改造也可能会间接地调节托品烷生物碱的合成和积累［38］。

托品烷生物碱生物合成途径中的相关反应步骤以及涉及到的酶基因尚未完全研究清楚，例如1⁃甲基⁃△⁃吡咯啉正离子生成前体托品酮的反应是如何进行的？苯丙酮酸生成苯乳酸是如何还原的以及限速步骤和限速酶都有哪些？虽然不同植物中对托品烷生物碱合成的调节是物种特异的，但是所有植物中的托品烷生物碱天然合成途径却是相同的。托品烷生物碱生物合成途径中的基因片段、关键酶、代谢网络调控机制以及转运机制等还有待进一步探索，目前相关的研究工作正在积极有序地开展。

4.2 萜类化合物的生物合成 萜类化合物是以C5为基本结构单元的化合物及其含氧和不同饱和程度的衍生物，包括类胡萝卜素、紫杉醇、丹参酮等，是中草药中重要的化合物，萜类化合物的通用合成途径已经基本阐明［39］。类胡萝卜素是萜类化合物的代表之一，研究发现，大肠杆菌4⁃磷酸甲基赤藓糖醇（MEP）途径的5 个基因（dxr、ispD、ispE、ispG、ispH）中，过表达ispG下游的ispH基因可以使β⁃胡萝卜素产量提高73%，ispG、ispH基因的协同表达是MEP 途径中重要限速步骤之一［40］，该研究对解析MEP 途径的调控机制和通过微生物细胞工厂大量生产萜类化合物具有重大意义。

紫杉醇是红豆杉Taxus baccataLinn.次生代谢产生的二萜类化合物，具有高效、低毒的特点，且抗癌活性良好。紫杉醇的生物合成大致可以分为3 个步骤［28］，分别为①紫杉烷环母核的合成，植物中所有萜类合成的共同代谢前体是异戊二烯，沿着异戊二烯代谢途径先合成紫杉烷骨架［紫杉⁃4（5），11（12）⁃二烯］，该步骤以4 个异戊二烯分子缩合生成的双（牻牛儿基）二磷酸盐（GGPP）作为起点，反应酶为紫杉二烯合成酶，最后环化为紫杉二烯；②骨架上的官能团反应，在紫杉二烯骨架上的相应位点发生羟基化等一系列的官能团反应，最终生成化合物巴卡亭Ⅲ，它作为直接前体参与到紫杉醇的代谢合成途径中；③合成紫杉醇的侧链，侧链在氨基变位酶的催化下生成，却是分2 步连接的，在酰基转移酶的催化下先形成N⁃苯甲酰紫杉醇，再经过羟基化修饰和苯甲酰化修饰生成紫杉醇。关于紫杉醇详细的合成过程和反应机理以及相关酶基因还没有研究完全，要通过生物合成实现大量生产紫杉醇还要不断努力。目前，通过紫杉醇的抗肿瘤生物活性，研制出了很多新型制剂，包括聚合物胶束、纳米颗粒、药物前体等［41］，但在疗效方面还有待提高。

丹参酮是唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.中的一种有效成分，是二萜醌类化合物，与其他二萜类化合物一样，以MEP 途径或MVA 途径这2 条萜类化合物通用前体合成途径为起点，参与其中的重要酶包括一系列的焦磷酸合酶、细胞色素P450 家族蛋白CYP76AH1等，中间产物包括共同前体GGPP、半日花二烯／古巴基二磷酸酯（CPP）、丹参酮二烯、铁锈醇、次丹参酮等，最后合成丹参酮类化合物［42］。在认识生物合成途径的基础上，熊丙全等［43］以茉莉酸甲酯为诱导子，研究丹参毛状根毛中次生代谢途径的调控，结果表明，诱导后丹参酮Ⅰ的含量提高到1.53倍，丹参酮ⅡA的含量提高到1.16 倍；丹参中的另一种活性成分酚酸类化合物，相比于未诱导时，迷迭香酸的含量提高到1.37倍，丹酚酸B 的含量提高到4.43倍，提示茉莉酸甲酯参与丹参毛状根中丹参酮类化合物代谢途径的调控，对丹参酮类和酚酸类活性成分的积累具有正效应。Guo 等［10］对丹参酮的生物合成途径进行研究，通过比较转录组学等技术筛选得到2 个细胞色素氧化酶P450 基因（CYP76AH3、CYP76AK），将这2 个功能基因引入设计好的底盘细胞中，得到的酵母工程菌株能同时产生6 种二萜类代谢产物，这为生物体中丹参酮生物合成途径的阐明、代谢网络的调控、关键酶基因的研究、微生物细胞工厂生产等奠定基础。Shi 等［44］研究表明，从丹参（原变种）Salvia miltiorrhizaBunge 毛状根中克隆了2 个新基因SmJAZ3、SmJAZ9，这2 个基因在代谢途径中调控丹参酮的生物合成，在茉莉酸信号途径中起抑制性转录调节剂的作用。Pei等［45］提出SmJAZ8 基因作为茉莉酸诱导的丹酚酸和丹参酮生物合成中负反馈回路控制器的新作用，SmJAZ8 基因的遗传转化改变了其他SmJAZ基因的表达，表明在茉莉酸调控的次级代谢中发生串扰迹象，为将来详细研究其分子机制打下基础。张建红等［46］采用RT⁃PCR 法、生物信息学分析、遗传转化、化学检测、代谢组学分析等研究过表达丹参毛状根中SmCYP81C16 基因，结果表明，SmCYP81C16对丹参酮的生物合成有正向调控作用，为丹参酮类化合物的高效生物合成奠定基础。

4.3 黄酮类化合物的生物合成 黄酮类物质是自然界中绝大多数植物都含有的一类含氧杂环的化合物，对植物的生长发育、抗菌防病等有重要作用，其基本碳骨架为C6⁃C3⁃C6，在植物中通常和糖结合形成苷类，是一种复杂的次生代谢产物［47］，此类物质具有抗氧活性、抗病毒能力、抗血管硬化、免疫调节、降低血糖、防治肿瘤等药理活性，甚至有些具备抗HIV 病毒的生理活性［48］。目前发现的黄酮类化合物已经多达4 000种，是许多中草药的活性成分［49］。

黄酮类化合物的生物合成途径以苯丙氨酸为起点，特点是具有2 个苯环，由中央3 个碳原子相互连接生成二氢黄酮类具有C6⁃C3⁃C6结构的基本骨架，通过分支途径合成黄酮、花色素等。Zhang 等［50］以番茄作为底盘细胞构建黄酮类化合物的异源合成途径，将拟南芥中AtMYB12 等基因进行过表达，将黄酮醇等化合物的含量增加到100 mg／g。Li 等［51］以大肠杆菌为底盘细胞人为设计一条黄酮合成途径，通过表达PAL、FNSI、4CL以及短SbF6H等不同物种的基因，使黄芩素、野黄芩素含量达到8.5、47.1 mg／L。通过对合成途径进行优化，提高丙二酰辅酶A 的利用率，使黄芩素、野黄芩素含量增加到23.6、106.5 mg／L，为黄酮的生物合成提供新的方式。何江等［52］对新塔花中黄酮类化合物的代谢通路进行分析，发现PAL、CHS、CHI、FNS这4 个基因在合成过程中起重要调控作用，为研究黄酮类化合物生物合成途径中的其他酶基因奠定基础。酶学研究方法和同位素原子示踪法等科学方法的发展应用将推动黄酮类次级代谢产物的生物合成途径的解析、途径酶以及调控网络。

5 展望

本文基于紫杉醇、丹参酮、黄酮等药用活性成分生物合成途径的阐明和基因的研究进行综述，发现通过底盘细胞构建生物合成途径能够合成一些重要的中间代谢产物或前体物质，使得药用植物次生代谢产物的产量都有不同程度的提高，体现出合成生物学技术的优势。但是这些活性成分有着复杂的合成步骤，至今尚未完全解析。随着合成生物学的发展，中药活性成分的生物合成途径、调控机制不断被阐明，相关转录调控因子、P450 酶等基因元件的研究也在不断深入，这将为药用活性成分的细胞工厂生产提供新的策略和生物元件，对药用活性成分的生物合成具有重大意义。药用活性成分的生物合成在产业化生产方面有很大上升空间。随着分子生物学技术、计算机技术等的发展，通过合成生物学技术进一步挖掘中药活性成分，进而实现药用活性成分的大量合成，为传统中药注入新的活力，提升我国研发创新性药物的能力和国际医药产业的核心竞争力。