液-液相分离在基因转录调控中功能机制的研究进展

液-液相分离是物理化学的一个基本概念, 用于描述2 种混合后的液体相互分离的现象。2009 年, BRANGWYNNE 等[1］在 显 微 镜 下 观 察到：线虫卵中P 颗粒以类似液滴的形式存在, 并且能够相互碰撞融合或分离, 首次表明细胞中的特定蛋白分子可以通过液-液相分离的方式聚集起来。近年来, 随着生物大分子的相变/相分离研究的快速发展, 科学家们[2-3］逐渐发现：细胞中许多蛋白质或者核酸分子之间均能够形成不断富集的高度有序的凝聚体, 在达到一定浓度后以液滴的形式析出, 形成相分离的无膜细胞器, 如旁斑、核斑点和应力颗粒等, 上述细胞器参与并且促进生物大分子的功能调控。相分离导致的相关物质异常堆积还与神经退行性疾病[4］和肿瘤[5］等疾病有关。因此, 这种液-液相分离液滴的形成揭示了一种普遍的生物分子聚集方式, 在细胞信号转导、代谢调控和染色质结构构建等许多基础生命活动中发挥重要功能。

研究[6］显示：液-液相分离参与基因表达转录的调控, 但其在转录调控中的机制尚未清楚。本文作者系统地总结了基因转录调节过程中, 重要蛋白大分子在染色质液-液相分离过程中的功能机制的相关研究进展, 列举了生物分子相分离形成的基本模式, 探讨了液-液相分离在染色质结构和转录调控方面的作用原理, 阐释了生物分子液-液相分离的转录调控机制, 旨在对研究基因转录调控在肿瘤疾病中的致病机制提供新的思路。

1 生物分子液-液相分离的概念和原理

生物分子的液-液相分离是指生物分子在细胞中聚集, 彼此相互靠近, 进而导致浓度增加并以液滴样物质的形式析出。液-液相分离形成的生物凝聚体之间、凝聚体与周围分子之间是动态的、可逆的, 凝聚体存在聚集-解聚的状态变化, 这些特性受凝聚体表面张力的调节[7］。在生理条件下, 液-液相分离形成的凝聚体主要依赖于生物分子间的多共价互作, 特别是蛋白结构域之间的多价互作, 如Nck 的Src 同源结构域3（Src homology domain 3, SH3） 重复结构域与N-WASP 的富脯氨酸结构模体（proline-rich motif, PRM） 重复结构域通过多价互作形成液-液相分离液滴, 且液-液相分离的程度受到蛋白分子间相对浓度以及价态所调节[8-9］。除了有序的结构域外, 蛋白分子的固有无序区域（intrinsically disordered regions, IDRs） 中 包 含 特殊氨基酸重复分布。低复杂度结构域中的氨基酸残基之间存在弱互作, 如阳离子-p、p-p 堆积、盐桥、静电、疏水和偶极等互作, 弱互作也可以驱动生物大分子形成液-液相分离的聚集[10-12］。因为一些蛋白的RNA 结合结构域和RNA 能够通过多种方式形成多价互作, 因此蛋白质与核酸之间易于聚集成液-液相分离的复合体, 如一些蛋白的RNA 结合结构域和RNA 能够通过多种方式形成多价互作, 这些互作可以影响特定蛋白与核酸形成相分离的程度[11］。

2 液-液相分离对转录的调控作用

细胞是生物体结构和功能的基本单位。生物体精确而适时地发挥生物学功能, 包括细胞生长、发育和细胞功能的维持, 均受到细胞特异性的基因组转录所调控。在细胞分化过程中, 细胞接收转录信号的刺激时开始转录, 而转录过程受表观遗传调控[13］。转录抑制时, 转录抑制因子在基因位点处富集并形成一个不活跃的转录复合体, 导致染色质凝缩, 进而使DNA 与转录激活因子和RNA 聚合酶分隔开[14］。转录激活时, 转录因子与特定DNA 序列的增强子结合, 招募辅助因子（如Mediator 和BRD4）, 与RNA PolⅡ在基因启动子处形成动态转录复合体。上述大的蛋白复合体通过液相分离在细胞核内形成动态的生物分子凝聚物[15］, 使调控转录所需组分的浓度增加, 互作增强。此外这些组分的互作还可以参与调控染色质结构构建、RNA加工和基因表达等其他生物学功能[16］。因此本文作者将从基因转录抑制、转录激活、转录延伸和剪接等方面阐述液-液相分离在基因转录中的研究进展。

2.1 液-液相分离调控异染色质的形成导致转录抑制不会混合的2 种液体（油和水）之间的分离被称为“液-液相分离”。研究[17-18］显示：液-液相分离能驱动转录活跃的常染色质部分转变为转录沉默的异染色质, 因此液-液相分离可以促进异染色质形成。异染色质蛋白1a （heterochromatin protein 1a, HP1a）是异染色质的动态部分, 其N 端延伸（N terminal extension, NTE） 区域被磷酸化或者与DNA 结合, 均促进其形成液-液相分离凝聚物, 并倾向于与异染色质的核小体和DNA 而不是转录因子TFIIB 进一步凝聚, 这表明HP1a 介导异染色质发生相分离, 促进染色质致密, 导致基因沉默。在果蝇的早期胚胎细胞中, 人类HP1a 同源蛋白—非磷酸化的果蝇HP1a 蛋白, 也可以通过液-液相分离介导异染色质的形成[18］。裂殖酵母中的Swi6 和植物中的ADCP1 蛋白均可以介导异染色质形成液-液相分离聚集[19-20］。

转录抑制因子甲基CpG 结合蛋白2 （methyl CpG binding protein 2, MeCP2） 是组成细胞中异染色质的重要组成部分。体外实验[21-22］显示：MeCP2 可以与核小体串珠形成液-液相分离的凝聚。MeCP2 诱导形成的液-液相分离液滴在加入DNA 后会结合并甲基化DNA, 从而进一步增强MeCP2 的液-液相分离凝聚[21-22］。MeCP2 形成的凝聚物选择性地结合并聚集异染色质辅因子, 而不是常染色质转录活性凝聚物的成分；MeCP2 通过与核小体串珠发生液-液相分离, 导致其与连接组蛋白H1 在同核小体形成液-液相分离时存在竞争行为, 在体外形成互斥的染色质液-液相分离液滴, 在体内形成各自不同的异染色质区域。在瑞特综合征（Rett syndrome, RTT） 中, MeCP2 在C 末端的IDR 或者甲基化DNA 结合结构域发生突变后, 均削弱了MeCP2 蛋白形成液-液相分离液滴的能力[21-22］, 并且氨基酸残基突变明显地降低甚至消除了MeCP2 与连接组蛋白H1 竞争结合染色质并发生相变的能力, 进而导致RTT[21-22］；上述研究结果表明：RTT 患者MeCP2 突变使其缺失了与连接组蛋白H1 竞争结合染色质并发生相变的能力, 不能压缩核小体串珠, 导致异染色质解聚, 从而使野生型中沉默的基因在转录水平上发生改变[21-22］。

兼性异染色质在形成过程中也会发生液-液相分 离[23］。多梳蛋白复合物（polycomb group protein, PcG） 是一类重要的表观遗传调控因子, 其主要通过压缩染色质结构, 催化形成组蛋白H3K27me3 甲基化修饰, 或者H2AK119ub1 泛素化修饰促进兼性异染色质的形成, 并以此维持了靶基因的沉默状态和转录抑制功能[23］。研究[24-25］显示：多梳抑制复合物1（polycomb repressive complex 1, PRC1） 的多梳色素框（chromobox 2, CBX2） 结构域在体外和细胞中均可发生液相凝聚, 而DNA和核小体对于CBX-PRC1 的凝聚起十分重要的促进作用。然而, PcG 蛋白多同源体（PcG protein polyhomeotic, Ph） 蛋白水平增加, 或者无菌α 基序（sterile alpha motif, SAM）的聚合均可以减弱PcG 在染色质上的结合和凝聚[26］。拟南芥B3 结构域蛋白VRN1 是一种PRC1 植物特异性的同源蛋白, 是植物响应春化过程的重要蛋白。研究[27］显示：VRN1 能够通过其串联B3 DNA 结合结构域以及IDR 与DNA 结合并产生液-液相分离聚集, 说明其可以通过液-液相分离调控染色质结构并抑制基因转录。

核基质蛋白是一种富集于细胞核中的网状结构蛋白, 具有结合RNA 的功能, 对调节染色质高级结构和基因表达至关重要[13,28］。研究[6］显示：核基质结合因子B （scaffold attachment factor B, SAFB） 可以与多种RNA 发生结合, 其中包括异染色质重复序列的主要卫星RNA （major satellite RNAs, MajSAT RNAs）。 SAFB 和 MajSAT RNAs 均是着丝粒周边异染色质（pericentromeric chromatin, PCH）形成所必需的, MajSAT RNAs在细胞核中与SAFB 存在共定位并形成复合物, 促进着丝粒周边异染色质的液-液相分离, 在维持异染色质高级结构过程中起协同作用。

2.2 液-液相分离在转录激活与转录起始过程中的作用基因在转录过程中需要在活性基因附近组装多种蛋白因子, 如顺式调控元件（启动子和增强子） 和反式作用因子（转录因子、共激活因子和RNA Pol Ⅱ） 等, 与RNA 聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ） 形成转录复合体共同参与并调控基因表达。近期研究[29］显示：在转录起始时, 转录因子聚集在增强子位点上, 与转录机器的关键组件（包括Pol Ⅱ）互作形成了液-液相分离的凝聚。

FET [包 括 融 合 肉 瘤 （fused in sarcoma, FUSa）、尤因肉瘤和TATA 结合蛋白相关因子15（TATA-binding protein-associated factor 15, TAF15）］ 蛋白家族是参与并形成转录复合体的重要转录因子。FET 蛋白家族的成员均是RNA 结合蛋白, 其N 末端低复杂度IDR 结构域包含不带电荷的极性氨基酸和芳香族氨基酸富集序列、RNA识别结构域、富含精氨酸和甘氨酸的结构域[30-31］。研究[32］显示：FET 蛋白家族N 端的IDRs 可结合RNA 聚合酶Pol Ⅱ的C 端结构域（C-terminal domain, CTD）, 从而激活下游基因的转录, 但Pol Ⅱ在CTD 区域的磷酸化修饰会导致转录活性下降。FET 蛋白家族能形成液-液相分离的凝聚, 其中FUS 相分离主要是由朊病毒样结构域的酪氨酸残基和RNA 结合域[11,33］的精氨酸残基之间的多价相互作用所驱动, 而TAF15 凝聚物通过与TFⅡD 和PolⅡCTD 等DNA 结合因子的相互作用, 稳定液-液相分离凝聚物的组成以及驱动转录过程[34］。

OCT4 和GCN4 等转录因子的转录激活域通常包含较长的无序IDRs, 这些IDRs 对于OCT4 和GCN4 等转录因子在细胞核中形成特殊的液-液相分离凝聚以及调控转录激活十分重要[10, 35］。其他转 录 因 子 如 MYC、 p53、 NANOG、 SOX2、RARa、GATA2 和ER 在体外条件下均可各自形成相分离的液滴[35］。在继续滴加中介辅助激活因子MED1-IDR 后, 这些转录因子形成液相分离的效果可进一步增强[35］。此外, 转录因子TEAD4 与转录共激活子TAZ、BRD4 和Med1 以及转录调控因子CDK9 在核内可以共同形成凝聚物, 更进一步促进转录反应[36］, 说明不同的转录因子可以通过其IDRs 的相分离能力与转录辅助因子相互作用。

转录辅助因子MED1 和BRD4 在超级增强子上形成液-液相分离的凝聚物, 将转录机器蛋白聚集在关键基因的超级增强子处, 实现转录的区室化反应[37-38］, 这意味着超级增强子上液-液相分离的发生与转录调控相关[37］；BRD4 短亚型也可与BRD4长亚型、MED1、CDK9 和RNA Pol Ⅱ形成液-液相分离凝聚物调控基因的表达[39］。共激活因子p300 可与转录因子（p63 和SOX2） 和BRD4 形成凝聚物, 而后促进p300 的反式激活, 进而转录发生, 调控相关基因的表达[40］。巨型反式转录因子如GATA 结 合 蛋 白3 （GATA binding protein 3, GATA3） 和 雌 激 素 受 体α （estragen receptor α, ERα）在增强子区域的结合同时需要多种转录因子和辅助因子的共同协作, 这种多种因子参与的增强子转录激活复合体可以形成液-液相分离的聚集[41］。 MegaTrans 中 的 增 强 子RNA （enhancer RNA, eRNA） 与增强子核糖核蛋白（enhancer ribonucleoprotein, eRNP）结合形成具有液-液相分离 特 性 的 复 合 体[41］, 而 且eRNA 可 以 促 进MegaTrans 增强子液-液相分离凝聚物的动态构成, 表明eRNA 在染色体构造和增强子激活中有重要作用[41］。

2.3 液-液相分离在转录延伸-剪接中的作用研究[42-43］显示：生物大分子凝聚物在转录过程中可以选择性地停留在不同基因区域, 如Pol ⅡCTD结构域的磷酸化状态决定了Pol Ⅱ是否停留在增强子-启动子区域, 还是在转录延伸-剪接区域并促进成熟RNA 的形成。RNA Pol Ⅱ的CTD 结构域未被磷酸化时, 可与Mediator 或FET 蛋白形成液-液相分离液滴, 有助于转录激活；而当Pol Ⅱ CTD结 构 域 被P-TEFb 或DYRK1A-6磷酸化后, 磷酸化后 的Pol ⅡCTD 从Mediator 和FET 凝 聚 体 中 析出[39］, 参与到以SRSF2 为主形成的RNA 剪接复合物的液-液相分离凝聚体中, 从而促进转录延伸和RNA 剪接[43］, 说明细胞核中蛋白质无序IDRs 的磷酸化修饰可以促使该蛋白完成从一种液-液相分离凝聚至另一种液-液相分离凝聚的转化。

正性转录延伸因子b （positive transcription elongation factor b, P-TEFb） 亚 基 周 期 蛋 白T1（cyclin T1, CycT1） 和重组双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A （recombinant dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A, DYRK1A） 均含有进化上保守的组氨酸结构域（histidine rich domain, HRD）, HRD 与上下游序列形成IDRs, 该区域依赖HRD 形成液-液相分离凝聚物, 从而调控转录的延伸[21,44］。P-TEFb 既能磷酸化负向延伸因子DSIF 和NESF, 并解除转录延伸抑制作用；也能使RNA Pol ⅡCTD 高度磷酸化, 从而参与形成延长-剪接复合物凝聚物, 促进转录延 伸 和RNA 剪 接[21,44］。在 细 胞 中, P-TEFb 通 常与能够抑制其活性的HEXIM1/2 结合, 以无活性蛋白复合体的形式存在[45］, 而活化的P-TEFb 与转录因子结合, 参与形成超延伸复合体（super elongation complex, SEC）[46-47］。 研 究[48］显 示：SEC 亚基ELL 和AFF4 的IDR 之间的多价互作促进了SEC 液-液相分离。SEC 凝聚物能够将与HEXIM1 结合的无活性P-TEFb 募集到启动子上, 对Pol Ⅱ的释放至关重要[48］, 表明SEC 液-液相分离凝聚物的形成在控制转录停滞与Pol Ⅱ释放过程中起关键作用。

RNA 剪 接 因 子（SRSF2、SF3B1、U2AF2、HNRNPA1、 SRSF1、 SRRM1、 PRPF8 和SNRNP70）可在活性基因体的超级增强子上形成不同的液-液相分离凝聚物, 表明这些凝聚物的形成可能是通过新生RNA 与剪接机制组成部分之间的 互 作 驱 动 的[15,43］。然 而 高 度 磷 酸 化 的Pol ⅡCTD 偏向于进入剪接因子凝聚物, 而低磷酸化的CTD 更偏向于形成中介复合物[43］。蛋白磷酸酶中的蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1, PP1） 可对CTD 结构域的Thr4P 去磷酸化, 导致CTD 在去磷酸化后从多个剪接因子形成的凝聚物中分离出来, 说明CTD 磷酸化调控了凝聚物功能从转录起始复合物到RNA 剪接复合物的转变[35,43,49］。

3 问题和展望

液-液相分离现象从根本上改变了学者对转录调控机制的理解, 细胞核中液-液相分离凝聚物的形成并发挥生物学功能是基因转录调控的基础。转录因子、共激活因子、RNA Pol Ⅱ和延伸-剪接复合物中的特异性因子之间的多价互作形成不同的液-液相分离凝聚物, 在不同基因位点发挥不同的功能。液-液相分离建造了无膜隔室, 并将生物分子凝聚组成核凝聚物, 在应激状态下可促进或抑制基因表达, 保证基因表达反应高效进行且互不干扰。因此, 核凝聚物形成的生物物理过程和发挥功能的模式更深入地阐明了染色质的动态结构和基因表达调控的机制。

尽管目前液-液相分离研究已经取得了诸多进展, 但仍有许多关键问题亟待探讨。首先尚未完全了解在特定基因组位点上, 是何种信号触发了从分子累积到形成液-液相分离聚集物的独特转录机制, 以及何种特定信号或转录周期调控机制能够解聚液-液相分离凝聚物；其次需要探讨在转录调控的其他方面, 如转录终止和前体mRNA 的加工是否也与液-液相分离的调控相关；如相关, 则RNA Pol Ⅱ和终止子在这些液-液相分离凝聚中起何种作用？再次, 如果RNA Pol Ⅱ依赖于CTD 结构域磷酸化/非磷酸化模式, 在不同的液-液相分离凝聚物之间传送, 那么在转录后修饰过程中, 转录因子与辅助因子的IDRs 以及转录相关因子是否与液-液相分离凝聚物的形成和解聚相关？研究[50］显示：FET 蛋白的突变加速了从液态到固态的异常相变, 增加了神经退行性疾病肌萎缩性脊髓侧索硬化症的风险, 因此, 未来需要进一步研究异常的液-液相分离是否以及如何导致基因异常转录和疾病发生。