番石榴叶精油对曲纹紫灰蝶的驱避活性和触角电生理*

黄 华 凌斯全 邱华龙 钟家美 徐金柱

（1.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520；2.广东省肇庆市封开县林业局森林病虫害防治检疫站，广东 肇庆 526500）

曲纹紫灰蝶Chilades pandava隶属鳞翅目Lepidoptera 灰蝶科Lycaenidae 紫灰蝶属Chilades，是我国外来入侵害虫。该虫从90 年代中后期开始传入我国大陆，现已广泛分布于广西、广东、海南、福建等10 多个省（自治区）[1]。曲纹紫灰蝶幼虫食性较为单一，寄主为苏铁属植物，以幼虫群集啃食新梢、茎端组织和球花，形成缺刻，为害严重时嫩叶被吃光，球花萎靡干枯倒垂，胚珠、花粉不能成熟[2-4]，抽芯连续受害后，植株生长缓慢或枯死[4]，严重影响苏铁的生长繁殖和资源保存，影响城市园林绿化美观和经济效益。目前，主要使用化学农药来防控曲纹紫灰蝶，但因其世代重叠，虫卵小、幼虫多隐藏于苏铁羽叶背面，不易被发现而错过最佳防治时期，并且成虫迁徙能力强，飞离施药区域从而规避农药，给防治带来困难[5]。此外，苏铁作为城市园林的重要景观树种，过量、频繁喷施化学农药使曲纹紫灰蝶产生抗药性，导致药剂的使用剂量加大，对环境和人类健康产生不良影响。

植物精油又称挥发油，是植物体内分子量较小的一类次生代谢产物，其主要化学成分为萜类、芳香族、脂肪族和含氮含硫等挥发性有机化合物[6]。植物精油含有丰富的活性成分，对昆虫具有熏蒸、驱避、触杀和抑制生长发育活性[7]，同时还能影响昆虫寻找寄主、交配、产卵和取食等行为[8-9]。植物精油具有对人畜安全、易降解、无残留等优点[10]，近年来已成为害虫防治研究的热点。

番石榴Psidium guajava含有丰富的植物次生代谢物，如酚类、黄酮类、类胡萝卜素、三萜类和精油等成分，具有良好的保健功效[11-12]。已有研究表明，番石榴叶精油对多种农业害虫具有驱避作用[13-15]，且可抑制害虫的取食行为[16]，是潜在的昆虫行为调控剂，在城市园林害虫的防治上同样具有广泛的应用前景。本研究利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析了番石榴叶精油的化学组成，同时测定了本精油及其主要成分对曲纹紫灰蝶的驱避活性和触角电生理活性。旨在探索利用番石榴叶精油及其主要活性成分作为曲纹紫灰蝶的植物源驱避剂，为曲纹紫灰蝶的绿色防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设备

曲纹紫灰蝶幼虫采集于肇庆市封开县县人民政府广场的苏铁Cycas revoluta新梢上，将幼虫连带新梢转移至养虫笼于人工气候箱内饲养（26±1 ℃，湿度70%～80%，光周期16/8 h）。羽化后，放入一团含20%蜂蜜水的脱脂棉供成虫取食。珍珠番石榴叶片采集于华南农业大学园艺教学实验基地，室内阴凉处风干后备用。

主要试剂：(E)-β-石竹烯（＞ 90%），梯希爱（上海）有限公司；C7～C30 饱和烷烃混标（1 mg/mL，正己烷配制），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；正己烷（色谱纯），福晨（天津）化学试剂有限公司；其他一些试剂为国产分析纯。主要设备：气相色谱-质谱联用仪（8890-5977B GCMS），美国Agilent；气相色谱-触角电位仪（GCEAD），荷兰Syntech；Y 型嗅觉仪（臂长20 cm，夹角80°，内径3 cm）和精油蒸馏萃取装置，广州市精科化玻仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 番石榴叶精油的提取与化学成分分析 采用水蒸气蒸馏法提取番石榴叶精油[17]。将阴干的番石榴叶粉碎，过20 目筛，取50 g 粉末，置于2 000 mL 圆底烧瓶中，加入500 mL 蒸馏水，打开电热套加热圆底烧瓶至沸腾，并一直保持微沸直至无油状物流出为止（约5 h）。用二氯甲烷萃取馏出液，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发去除二氯甲烷，精油置于棕色瓶中，密封，4 ℃保存备用。

番石榴叶精油用正己烷稀释至0.5 μL/mL (v/v)，然后在Agilent GC-MS 上对组分进行分析。进样量为1 μL，无分流模式，进样口、连接口和四极杆温度分别为250 ℃、280 ℃和150 ℃，载气为氦气（1.2 mL/min）。色谱柱为HP-5MS（30 m× 0.25 mm × 0.25 μm），升温程序为：初始温度60 ℃（保持2 min），4 ℃/min 升温至150 ℃（保持10 min），然后以8 ℃/min 升温至250 ℃（保持2 min），最后以10 ℃/min 升温至280 ℃（保持10 min）。在同样仪器条件下，以饱和烷烃混标（C7～C30）来计算各挥发物成分的保留指数（Retention index，RI）[14]。通过匹配NIST17 数据库中化合物的质谱特征峰、RI 值以及标准品比对来鉴定挥发物。采用峰面积归一化法计算精油各成分的百分含量。

1.2.2 曲纹紫灰蝶嗅觉选择行为测定 本试验选用Y 型嗅觉仪测定曲纹紫灰蝶对番石榴叶精油的行为反应，参考于金鑫等的方法[18]，有所修改。在Y 型管两侧臂前方（位于Y 型管中线且距两侧臂前端均为10 cm，保证照射到两侧臂的光强一致）放置一个10 w 灯泡，利用趋光性来提高曲纹紫灰蝶的出管选择率。将番石榴叶精油用正己烷稀 释 至0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 或5 μL/mL，吸取10 μL 稀释后的精油滴入200 mL 洗气瓶内的滤纸片上，以10 μL 正己烷为对照，然后连通Y 型嗅觉仪，气流设定为200 mL/min。从Y 型管主臂端口释放曲纹紫灰蝶雌成虫，在5 min 内，试虫在Y 型管某一侧臂内前进超过臂长三分之一则认为该试虫选择了该臂。未选择任何侧臂以及在侧臂内前进不超过三分之一的试虫则被视为无反应试虫。每测试10 头试虫后，调换Y 型管两侧臂的位置，消除几何位置对试虫的影响。测试40头试虫后，更换另一支干净的Y 型管继续试验。已用过的Y 型管则用酒精清洗，烘干备用。每浓度测试40 头曲纹紫灰蝶雌成虫。测试时间为每天的8:00—17:00 时，室内条件为温度26±1 ℃，湿度70%～80%，光周期16/8 h。按照以下公式计算驱避率：驱避率（%）=（选择对照的虫数-选择精油的虫数）/选择对照的虫数×100%。

将(E)-β-石竹烯稀释至0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 或5 μL/mL，以正己烷为对照，以同样的方法测定曲纹紫灰蝶对(E)-β-石竹烯的嗅觉行为反应。

1.2.3 曲纹紫灰蝶触角电位测定 采用GC-EAD测定曲纹紫灰蝶触角对番石榴叶精油组分的触角电位反应。在体视镜下将曲纹紫灰蝶雌成虫触角从基部切下，切掉触角尖部一节（约1 mm）。把触角的两端分别连接已吸取0.9%生理盐水的毛细玻璃管，两根毛细玻璃管分别连接参考极和测量极，完成触角与电极的搭连[19]。色谱柱为HP-1（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），进样口和检测器温度分别为250 ℃和280 ℃，升温程序与GC-MS分析相同。番石榴叶精油经正己烷稀释至0.5 μL/mL，取2 μL 手动进样，经色谱柱分离后1 ∶1 分流至FID（氢火焰离子化检测器）和EAD。GcEad 2014 软件（Syntech）采集气相色谱和触角电位反应数据。重复测试5 头雌虫触角，每次重复中均有电位变化的表示触角对该挥发物有电位反应。

此外，测定曲纹紫灰蝶对不同浓度（0.005、0.01、0.05 和0.1 μL/mL）的(E)-β-石竹烯的触角电位反应，每浓度5 次重复，测定方法同上。

1.3 数据处理

采用Microsoft excel 2021 进行数据整理，使用SPSS statistics v23.0 软件对数据进行统计分析，采用χ2检验分析Y 型嗅觉选择行为试验中选择两臂试虫的差异，采用Duncan’s 检验比较多组数据间的差异，P＜ 0.05 或0.01 表示差异显著或极显著。

2 结果与分析

2.1 番石榴叶精油化学成分

采用水蒸气蒸馏法获得0.21 mL 番石榴叶精油，提取率为0.42%。GC-MS 的总离子流图基线平稳，色谱峰分离良好，有利于挥发物的质谱鉴定（图1）。番石榴叶精油含有46 种挥发物，通过与NIST 数据库和文献比对，共鉴定38 种挥发物，其中(E)-β-石竹烯含量最高，为32.47%（表1）。其它主要成分依次为α-古巴烯（10.44%）、菖莆烯（8.19%）、蓝桉醇（7.19%）、香橙烯（5.01%）、β-红没药烯（3.99%）、葎草烯（3.79%）、δ-杜松醇（2.54%）、表-α-依兰油醇（2.13%）、柠檬烯（2.10%）和α-红没药烯（2.05%）等。分类分析表明，精油成分主要为倍半萜和氧化倍半萜，含量分别为74.75%和19.25%，而单萜及其氧化物含量较低，仅为2.81%和0.33%。

表1 番石榴叶精油成分及含量分析Table 1 Essential oil compositions and contents of guava leaves

注：1-单萜，2-氧化单萜，3-倍半萜，4-氧化倍半萜，5-其它。Note: 1-Monoterpene hydrocarbons，2-Oxygenated monoterpenes，3-Sesquiterpene hydrocarbons，4-Oxygenated sesquiterpenes，5-Others.

图1 番石榴精油GC-MS 总离子流色谱图Fig. 1 GC-MS total ion current chromatogram of guava leaf oil

2.2 番石榴叶精油对曲纹紫灰蝶的驱避活性

Y 型嗅觉仪测定的结果表明，番石榴叶精油浓度低于0.05 μL/mL 时，对曲纹紫灰蝶的嗅觉选择行为无显著影响，而当精油浓度为0.1～5.0 μL/mL 时，曲纹紫灰蝶对精油的选择率分别为35.29%、21.21%、25.81% 和23.53%，显著低于(P＜0.05)对照（图2a）。根据精油各成分的含量，本试验选取主要成分(E)-β-石竹烯进一步分析。结果表明，(E)-β-石竹烯同样影响曲纹紫灰蝶的行为，在浓度为0.05～5.00 μL/mL 时抑制曲纹紫灰蝶的选择（图2b），表现出显著(P＜0.05)的驱避作用。

图2 番石榴叶精油和(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶嗅觉选择行为的影响Fig. 2 Effect of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene on the olfactory selection of C. pandava

计算不同浓度番石榴叶精油和(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶的驱避率，结果如表2 所示。浓度为0.005～0.5 μL/mL 时，随着番石榴叶精油浓度的升高，驱避率逐渐升高，并且在0.5 μL/mL 时，驱避率达73.08%。在测试浓度下，(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶的驱避率（y）与化合物浓度的log10对数（x）呈现较好的线性关系（R2=0.93），浓度为0.1 μL/mL 时的驱避率为58.33%，而0.5 μL/mL 的驱避率为68.00%，略低于相同浓度的番石榴叶精油。

表2 番石榴叶精油和(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶的驱避活性Table 2 Repellent activities of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene against C. pandava

2.3 曲纹紫灰蝶对番石榴叶精油和(E)-β-石竹烯的触角电位反应

采用GC-EAD 鉴定和分析了番石榴叶精油成分对曲纹紫灰蝶的触角电位活性。从图3a 中可知，曲纹紫灰蝶对α-蒎烯、柠檬烯、α-古巴烯、(E)-β-石竹烯、香橙烯、葎草烯、β-红没药烯和菖莆烯有明显的触角电位反应，其中对(E)-β-石竹烯的反应最强，其次是α-古巴烯和柠檬烯。根据本试验和行为测定的结果，进一步测定了曲纹紫灰蝶对主要成分(E)-β-石竹烯的触角电位反应。如图3b 所示，0.005～0.1 μL/mL 的(E)-β-石竹烯均能引起触角电位变化，并且随着化合物浓度的升高触角电位变化越明显，平均值分别为-0.010、-0.015、-0.038 和-0.142 mV，具有显著性差异(P＜0.05)。

图3 番石榴叶精油和(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶触角电生理的影响Fig. 3 Effect of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene on the electroantennography of C. pandava

3 结论与讨论

植物精油是植物用来保护自身的重要次生代谢物质，单萜和倍半萜及其衍生物是其主要成分，并且对昆虫具有较强的行为和生理干扰作用[20]。目前，科学界在植物精油对农业害虫驱避效果方面的研究进行了大量的探讨，但对观赏植物上的曲纹紫灰蝶的驱避作用研究还较少。

本研究采用GC-MS 对番石榴叶精油的化学组成进行了分析，结果表明，番石榴叶精油中主要含有46 种挥发物，共鉴定38 种，主要是倍半萜及其氧化物（相对含量＞90%），其中(E)-β-石竹烯的含量最高（32.47%），与前人的研究结果相一致[14,21]。活性测定表明，番石榴叶精油对曲纹紫灰蝶雌成虫具有显著的驱避作用，在0.5 μL/mL时，驱避率达73.08%，但随着浓度的进一步升高，但驱避率不显著变化，其原因尚不清楚。番石榴叶精油的主要成分(E)-β-石竹烯对曲纹紫灰蝶同样具有驱避作用，在0.5 μL/mL 时的驱避率为68.00%。GC-EAD 测试结果表明，番石榴叶精油中多种挥发物成分引起曲纹紫灰蝶触角的电位变化，其中(E)-β-石竹烯的作用最为明显，并且具有明显的浓度依赖性，表明(E)-β-石竹烯是番石榴叶精油对曲纹紫灰蝶有驱避活性的主要成分。已有研究表明，一定浓度的(E)-β-石竹烯及其氧化物对柑橘木虱和橘小实蝇等害虫有驱避或行为干扰作用[22-24]。因此，番石榴叶精油及(E)-β-石竹烯具有进一步开发为曲纹紫灰蝶植物源驱避剂的潜力。

植物精油中含量高的主要成分的驱避作用往往弱于精油本身的活性，而几种精油单组分化合物混配后驱避效果往往优于其单剂驱避效果，表明植物精油对害虫的驱避活性可能是各组分之间的协同作用[9,25]。例如，邻二甲苯（10-4）和(E)-β-石竹烯（10-6）在混配后对普通大蓟马Megalurothrips usitatus表现出极显著的驱避作用[26]。本研究中，除(E)-β-石竹烯外，α-蒎烯、柠檬烯、α-古巴烯、香橙烯、葎草烯、β-红没药烯和菖莆烯也能引起曲纹紫灰蝶触角电位的变化，表明这些挥发物成分也可能影响曲纹紫灰蝶的行为，并且可能和(E)-β-石竹烯发挥协同作用。因此，加强植物精油有效成分协同作用的研究对提升曲纹紫灰蝶的防控效果具有重要意义。后期试验拟进一步鉴定番石榴叶精油中含量较低的驱避活性成分，探究多种驱避活性成分间的协同增效作用，并进行田间试验。