易错PCR定向进化技术提高蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10核酸酶活性的研究

王 珏，吴 娜，张育敏，闫海洋，胡丽丽

(山西中医药大学基础医学院，山西 晋中 030600)

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)是植物在遭受病原菌侵害或外界环境压力下产生的一种抗逆的、有利于自身生长发育的蛋白质，分为17个家族，其中PR-10类蛋白具有核酸酶活性[1]，被认为与降解RNA类病毒有关[2]。蒙古黄芪病程相关蛋白-10(Astragalusmembranaceuspathogenesis-related protein-10，AmPR-10)由158个氨基酸残基组成，分子大小约为16.8 kDa。目前已有研究证明天然提取的和重组的AmPR-10都具有核酸酶活性，但是活力均偏低[3-4]，不利于更深入的研究及大范围的应用。

酶分子的定向进化是由美国科学家Arnold F H于1993年首先提出，技术理念是通过模拟自然进化机制，对酶基因进行体外修饰，产生基因多样性，利用高通量筛选技术，获得具有预期特性的修饰酶[5]。定向进化可利用多种手段诱导目的基因碱基发生增添、缺失、替换等突变，代表性的方法为易错PCR[6]。易错PCR定向进化技术不需要对蛋白质结构有充分的了解，目前已在获取高活性的几丁质酶A[7]、γ谷氨酰转移酶[8]、β-1,4-葡聚糖内切酶[9]等方面得到了应用。

作者所在课题组[4]前期利用大肠杆菌表达体系构建了AmPR-10的2个重组子：pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10，其中skp是来源于大肠杆菌的分子伴侣，由161个氨基酸构成。外源诱导表达结果显示分子伴侣skp修饰后，AmPR-10表达量显著提高。因此，作者选择分子伴侣skp修饰的AmPR-10全基因skp-AmPR-10为研究对象，通过易错PCR定向进化技术筛选核酸酶活性提高的AmPR-10突变体，为进一步探索AmPR-10的作用机制提供理论依据，为其它同源蛋白的基因定向进化提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

重组子pET30a-skp-AmPR-10由山西中医药大学基础医学院克隆合成。

感受态细胞E.coliBL21、质粒提取试剂盒、超级感受态制备试剂盒、蛋白纯化试剂盒、96孔细菌培养板、2×Taq PCR Master Mix，生工生物工程(上海)有限公司；限制性内切酶NcoⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

TC-XP-G型PCR仪，杭州博日科技有限公司；TGL23M型高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；BSD-400型振荡培养箱，上海博讯实业有限公司；01A037型超声破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；WD-9413B型凝胶成像分析仪，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AmPR-10基因定向进化模板的选择

参照文献[4]进行重组子pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10构建过程中skp及AmPR-10的扩增、引物的设计、重组子的克隆、目的蛋白的诱导表达等。通过比较重组子pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10对目的基因的表达情况，发现后者可溶性表达量更高，因此，确定pET30a-skp-AmPR-10为目的基因定向进化的野生型。

1.2.2 目的基因skp-AmPR-10的易错PCR

以重组子pET30a-skp-AmPR-10的质粒为易错PCR模板，在PCR体系中添加不同浓度(0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1)的Mn2+以确定合适的突变率。以skp-AmPR-10作为目的基因设计上下游引物，上游引物：5′-CTAGCCATGGTGAAAAAGTGGTTATTAGCT-3′(划线部分为限制性内切酶NcoⅠ的酶切位点)；下游引物：5′-CCGCTCGAGCTTGTATTCAGGATTGGCCA-3′(划线部分为限制性内切酶XhoⅠ的酶切位点)。PCR体系为：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，质粒模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，氯化锰溶液1 μL，加ddH2O补足50 μL。

1.2.3 超级感受态的制备及突变体文库的构建

将获得的含有一定突变率的目的基因经过酶切回收后与载体pET30a连接，将连接产物加入到提前取出冰上融化的E.coliBL21感受态细胞中，按超级感受态制备试剂盒操作说明制备转化效率更高的超级感受态。将复活后的菌液涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养30 min后，将培养皿倒置过夜培养，构建转化子数量较高的突变体文库。

1.2.4 单克隆的诱导表达

将固体培养基上的菌落逐个挑到96孔细菌培养板中(每孔含200 μL已添加抗生素的LB培养基)，于37 ℃、200 r·min-1培养12～16 h；然后以2%的接种量将各孔中的菌液转接到新的96深孔板中(每孔含500 μL已添加抗生素的LB培养基)，加入IPTG进行诱导表达，剩余菌液与甘油以7∶3的比例混匀作为母板于-80 ℃冰冻保存；离心收集诱导后的菌体，于-80 ℃过夜冻存；每孔加入200 μL的RIPA细胞裂解液，于37 ℃放置1～2 h使菌体裂解；于4 ℃、4 000 r·min-1离心20 min，取上清，测定目的蛋白活性(以OD260值表征)。

1.2.5 高通量筛选方法的构建

以酵母tRNA为底物，构建AmPR-10核酸酶活性检测的高通量筛选方法。具体如下：配制2 mg·mL-1的酵母tRNA溶液，于96孔紫外酶标板中每孔加入50 μL酵母tRNA溶液与50 μL 菌体裂解后的蛋白液(以野生型蛋白液为对照)，37 ℃反应30 min；反应结束后通过酶标仪测定反应体系的OD260值(测3组平行数据，取平均值)，与对照组进行比较，筛选正向突变体。

1.2.6 突变体的复筛

高通量筛选方法建立的体系是微量的，在一定程度上存在误差，常用于目的基因定向进化的初筛。为进一步测定突变体的表达及活性，将初筛得到的突变体进行扩大培养，超声破碎菌体获得目的蛋白；通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况，纯化突变体蛋白；通过考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以酵母tRNA为底物，扩大反应体系，测定蛋白比活[10]。

2 结果与讨论

2.1 易错PCR Mn2+浓度的确定

分子伴侣skp由483个碱基组成(不包括终止密码子)，AmPR-10由477个碱基组成(包括终止密码子)，所以全基因skp-AmPR-10的扩增条带大小为960个碱基。在PCR体系中，分别加入不同浓度Mn2+的目的基因扩增产物的鉴定结果如图1所示。

M.DNA marker 1～6,Mn2+浓度(mmol·L-1):0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5

由图1可以看出，加入不同浓度Mn2+的目的基因扩增产物均在960 bp处显示明显条带；Mn2+可以降低PCR过程中Taq聚合酶的保真性，随着Mn2+浓度的增加，突变率升高，条带亮度也随之降低。因此，既要保证有一定的突变率，又要保证PCR产物量足够，选择0.3 mmol·L-1Mn2+进行突变体基因的扩增。

2.2 高通量筛选AmPR-10突变体结果

第一轮定向进化共筛选单克隆890个，然后通过高通量筛选方法测定96孔细菌培养板中所有单克隆突变体核酸酶活性(OD260值)，并计算扣除缓冲液样品对照平均值后的OD260值，结果见表1。

表1 突变体核酸酶活性检测原始数据及扣除缓冲液样品对照平均值后的OD260值

由表1可知，位于A4位置的突变体的核酸酶活性明显提高；缓冲液样品对照E1、F1、G1、H1的原始数据平均值为3.426，野生型样品对照A1、B1、C1、D1的扣除数据平均值为0.082，而突变体A4的扣除数据(0.155)最大。表明突变体A4的核酸酶活性可能较野生型有所提高，需要进行扩大培养，对其进行复筛。

2.3 突变体A4核酸酶活性的复筛和基因测序

野生型蛋白及突变体A4蛋白的表达及纯化结果如图2所示。

M.蛋白质marker 1,3,5分别为野生型蛋白未诱导、诱导及纯化后的鉴定结果 2,4,6分别为突变体A4蛋白未诱导、诱导及纯化后的鉴定结果

skp与AmPR-10融合表达后，蛋白大小约为34 kDa。由图2可以看出，突变体A4蛋白诱导和纯化后的SDS-PAGE图谱均在约34 kDa处出现明显条带(泳道4、6)，符合预期；并且与野生型(泳道3、5)相比，突变体A4的表达量并没有明显减少，说明基因突变没有影响目的蛋白的可溶性表达。

分别对野生型蛋白及突变体A4蛋白进行纯化，测定蛋白浓度；以酵母tRNA为底物，测定两者的比活。结果发现，野生型蛋白的比活为1.1 U·mg-1，突变体A4蛋白的比活为1.6 U·mg-1，较野生型提高45%。

野生型蛋白及突变体A4蛋白的基因测序结果如图3所示。

图3 野生型蛋白及突变体A4蛋白的基因测序结果

由图3可以看出，与野生型蛋白相比，突变体A4蛋白在465位处多了一个碱基A，使得第153个氨基酸密码子由CCT突变为CCA，但均编码脯氨酸，并导致后续基因排列的移码突变。很有意思的现象是，由于移码的出现，使得原来第154个氨基酸密码子变为TGA终止密码子，因此，突变体A4在蛋白编码过程中会提前终止，与野生型蛋白相比，缺少末端3个氨基酸，依次为：谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)。而且实验证明这3个氨基酸的缺失并没有影响目的蛋白的表达和活性，这一结果对探讨AmPR-10核酸酶活性机制具有重要参考意义。

通过SWISS-MODE建模，获得野生型蛋白和突变体A4蛋白的空间结构，使用Chimera软件对其进行初步分析，结果如图4所示。

由图4a可以看出，突变体A4蛋白缺失的3个氨基酸位于AmPR-10空间结构C末端的一段长α螺旋上(在SWISS-MODE建模中，最后一位赖氨酸没有显示)，已有研究[10]报道，这段区域对于AmPR-10展现核酸酶活性而言，保守性不强，可以作为基因定向进化的参考位点，而突变体A4蛋白的测序结果也对这一理性分析提供新的证据；另一方面，C末端的α螺旋结构犹如手柄状，对AmPR-10的空腔形成遮蔽作用，而空腔具有配体结合活性，在目的蛋白抗逆过程中发挥作用[11]。因此突变体A4在缺失了3个氨基酸后，α螺旋的长度缩短，进而对空腔的遮蔽作用减小，有利于蛋白与配体或底物的结合，这或许是突变体A4核酸酶活性提高的原因。

图4 野生型蛋白(a)和突变体A4蛋白(b)的空间结构示意图

2.4 讨论

(1)选择分子伴侣skp修饰的AmPR-10全基因skp-AmPR-10为研究对象，这一策略使分子伴侣skp分担了定向进化过程中的突变压力，可以避免仅以AmPR-10为目的基因时，进化范围(基因片段)较小而造成易死突变的现象，并且在一定程度上推迟进化平台期的出现，增加突变的多样性。研究方法利于正向突变体的筛选。

(2)以分子伴侣skp与AmPR-10串联的全基因为模板(skp位于AmPR-10上游)，进行了一轮易错PCR随机突变定向进化，得到了1个活性提高的突变体A4，其活性并没有达到理想状态，仅比野生型提高45%，其空间结构的C末端缺失了3个氨基酸(谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸)，但并未影响到目的蛋白的表达和活性。因此在后续研究中，可考虑以突变体A4为基础，进行第二轮定向进化，筛选活性进一步提高的突变体；或结合分子伴侣的作用，针对skp进行改造，通过优化目的蛋白的折叠和表达，实现核酸酶活性提高的目的。筛选核酸酶活性提高的AmPR-10突变体，是一项持续而重要的工作，在此过程中，可逐步挖掘影响其活性的关键位点或区域，从而得到高活性的AmPR-10，这对优化蒙古黄芪育种、降低种植过程中病原体侵袭造成的损失具有重要意义。

3 结论

以分子伴侣skp修饰的AmPR-10全基因为模板，通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库，以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法，获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体。突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45%；基因序列在465位增加了1个碱基A，C末端缺失了3个氨基酸，从而减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用，有利于目的蛋白与配体或底物的结合。该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义，为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础。