数据挖掘鉴定PRIM1与肝细胞癌不良预后相关

丁庆林，魏艳红, 胡康洪

(湖北工业大学中德生物医学中心，湖北 武汉 430068)

肝细胞癌(LIHC)作为最常见的、与多种信号通路改变相关的肝原发性恶性肿瘤，是全世界癌症相关死亡的第二大死因。大多数患者只在肝癌晚期表现出临床症状，其复杂的病理生理机制导致预后很差[1]。血清甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein , AFP)和计算机断层扫描(Computed Tomography, CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)的诊断成像已成为肝癌主要的诊断方式[2]。作为有价值的肝癌生物标志物，AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC-3)、Cluster of Differentiation 147(Cluster of Differentiation 147, CD147)、黏蛋白1(Mucin-1, Muc1)和上皮细胞黏附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule, EpCAM)等标志物检测的灵敏性和特异性有限[3]，应用生物标志物联用，可提高诊断准确率，已成为临床诊断癌症的新方向。因此，鉴定其他小分子在肝癌中的作用具有重要意义[2]。研究发现，mRNA前加工因子3(pre-mRNA processing factor 3, PRPF3)在多个LIHC肿瘤组织中上调，与较差的总生存期(Overall Survival, OS)和无病生存期(Disease-Free Survival, DFS)相关[4]；Kelch-like)蛋白家族成员21(Kelch Like Family Member 21, KLHL21)在LIHC中上调，其表达显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，代表最有可能进行治疗干预的靶标[5]；核小体组装蛋白1-like-1(Nucleosome Assembly Proteins 1-like 1 Protein, NAP1L1)在LIHC中高表达与侵袭性临床病理特征有关，促进化疗耐药性[6]；驱动蛋白家族成员C1(Kinesin Family Member C1, KIFC1)在LIHC中表达上调，通过调节上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)介导LIHC转移，并且与DFS和OS显著相关[7]。这些研究揭示了LIHC中具有预后意义的潜在基因靶标，也为PRIM1在LIHC中的研究提供了参考。

DNA引物酶亚基1(PRIM1)是异源四聚体真核聚合酶α-引物酶复合物的最小亚基，具有酶催化功能，对DNA合成具有关键作用，对细胞增殖同样十分重要[8-9]。PRIM1催化的RNA合成可激活DNA损伤反应[9-10]，PRIM1异常可影响细胞周期从G1期向S期的转变[11]；PRIM1下调和缺失可导致细胞S期停滞、延迟或延长[12]；PRIM1突变会诱导细胞凋亡[10]。研究表明，PRIM1与多种良性和恶性肿瘤疾病相关。PRIM1参与了雌激素诱导的乳腺癌形成[9]；PRIM1可能参与肺腺癌的发生[13]；PRIM1在体外和体内均可诱导肝癌细胞的增殖[14]。以上结果提示，PRIM1与多种癌症进程相关。PRIM1在LIHC中失调，提示其可能在LIHC的发生发展中具有潜在作用。

1 材料和方法

1.1 TIMER 2.0数据库

使用TIMER 2.0[15-17](http:∥timer.cistrome.org/)分析PRIM1在各类型癌症中的表达情况。

1.2 GEO数据库数据

从GEO数据库[18-19](https: ∥ www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)挑选包含LIHC肿瘤和非肿瘤样品的GEO基因芯片系列(GSE19665，GSE84402、GSE121248)，GEO芯片系列的平台和样品(表1)[20-22]。

表1 分析中包含的GEO系列详细信息

1.3 R语言分析

使用R语言版本3.5.1，通过R Limma[23]包将每个GEO数据集的微阵列原始CEL文件进行标准化，并将标准化的基因表达水平表示为log2转化值，比较肿瘤和非肿瘤样品mRNA的表达。使用R clusterProfiler[24]包的enrichplot功能和GOplot[25]包将共表达基因进行GO富集分析，包括生物学过程(Biological Process, BP)，细胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)与KEGG富集分析，并输出可视化结果。

1.4 UALCAN数据库分析

使用UALCAN[26](http:∥ualcan.path.uab.edu)分析各个癌症分期、肿瘤等级等肿瘤亚组中肿瘤和正常样品中基因的相对表达。

1.5 cBioPortal数据库分析

使用cBioPortal[27-28](http:∥cbioportal.org)分析了LIHC中PRIM1的突变情况，拷贝数变异(Copy number variation, CNV)，通过共表达模块功能分析出排名前50的共表达基因。

1.6 Kaplan-Meier Plotter数据库分析

使用Kaplan-Meier Plotter[29](https:∥kmplot.com/analysis/index.php?p=background)比较PRIM1高低表达组的生存时间差异。

1.7 OncoLnc 数据库

使用OncoLnc(http:∥www.oncolnc.org/)评估验证PRIM1对LIHC预后的影响。

1.8 The Human Protein Atlas数据库分析

使用The Human Protein Atlas(HPA)[30](https:∥www.proteinatlas.org/)比较PRIM1蛋白在肝癌组织和正常组织中的表达情况。

1.9 细胞培养和qPCR

对HL7702(正常肝细胞系，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和Hep G2(肝癌细胞系，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行10% FPS/DMEM培养，TRIZOL裂解细胞提取总RNA，逆转录获取cDNA。参考PRIM1引物序列[9]，通过LightCycler 96进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测PRIM1和内参基因β-actin的表达，评估PRIM1 mRNA在正常和肝癌细胞系中的表达情况。

2 结果

2.1 PRIM1 mRNA在LIHC中表达水平

TIMER数据库发现，PRIM1在包括LIHC在内的多种癌症中失调(图1a)，GEO数据库LIHC相关的多个GSE数据集、qPCR结果和HPA数据库免疫组化的结果均证实了PRIM1在LIHC中高表达(图1b-f)。

(a)PRIM1在包括LIHC在内的多种癌症中的表达水平

2.2 PRIM1表达与临床病理特征相关

为探究PRIM1表达量与临床特征之间的关系，对TCGA中371例HCC样品根据性别、年龄、种族、癌症分期、淋巴结转移状态、肿瘤分级和TP53突变状态(p<0.05)进行多亚组分析(图2)。

(a)样本类型 (b)性别

结果表明，PRIM1高表达且与患者性别无关(图2b)；41-60年龄组PRIM1表达明显高于61-80年龄组(图2c)，可区分不同年龄段患者；高加索组PRIM1表达低于亚洲组(图2d)，可区分不同种族；1～3期PRIM1表达高于正常组，4期出现大幅减低(图2e)，可辅助判断癌症分期；无转移组PRIM1表达高于正常组(图2f)，可判断是否出现转移；3级PRIM1表达显著高于1级(图2g)，可辅助判断肿瘤分级；TP53突变组显著高于未突变组(图2h)，表明TP53突变显著影响PRIM1表达。以上结果表明，高PRIM1表达与LIHC多种临床特征相关，可将PRIM1的表达作为LIHC中潜在的诊断指标。

2.3 PRIM1基因组突变和共表达基因

基因组突变与肿瘤发生密切相关[31]。为此，使用cBioPortal数据库分析了LIHC中PRIM1的基因组改变情况。数据显示，在353患者中有7例(2%)PRIM1 发生改变(图3a)。这些改变包括意义未知的错义突变1例，意义未知的截断突变1例和扩增5例的多种改变，且存在拷贝数变异(Copy number variation, CNV)和氨基酸点位突变(图3a-d)。以上结果提示，LIHC中发现PRIM1的基因改变，可能在LIHC的发生发展中具有潜在作用，有待深入探究。使用共表达模块，分析出与PRIM1共表达前50个关键基因。

图 3 LIHC中PRIM1的基因组突变

2.4 LIHC中PRIM1共表达基因的富集分析

PRIM1在LIHC中潜在的功能，可能是由于PRIM1基因组改变以及和多个基因共同作用的结果。为此，利用R语言 enrichplot和GOplot包对PRIM1共表达前50基因进行GO注释和KEGG分析(图4a-d)。

(a)生物学过程(BP)富集结

结果表明，其参与的生物学过程(BP)有：DNA复制、细胞周期检查点、有丝分裂核分裂、有丝分裂细胞周期G1/S期过渡、细胞周期G1/S相变等。组成的细胞成分(CC)有：染色体区域、染色体着丝粒区、浓缩染色体、染色体端粒区、复制叉、MCM复合体等。涉及到的分子功能(MF)有：ATP酶活性、作用于DNA的催化活性、DNA依赖性ATP酶活性、单链DNA结合、DNA复制起点结合、3′-5′ DNA解旋酶活性等。参与的信号通路(KEGG)有：细胞周期、DNA复制、错配修复、铂耐药等。对共表达基因进行富集分析，有助于了解PRIM1与其共表达基因在LIHC中的作用机理和过程。

2.5 PRIM1在LIHC中的预后价值

使用Kaplan-Meier Plotter数据库评估PRIM1表达与LIHC患者的预后关系。根据PRIM1表达水平的中位数，将患者分为两组。数据(图5)显示：与低表达组相比，PRIM1高表达组患者5年OS、无进展生存(Progression Free Survival, PFS)、无复发生存(Relapse Free Survival, RFS)和疾病特异性生存(Disease Free Survival, DSS)均较差(logrankp<0.05)(图5a-d)。OncoLnc数据库表明，PRIM1高表达与LIHC较差的OS相关。以上结果提示，LIHC中高PRIM1表达可能是一个独立的危险因素，其导致LIHC患者的不良预后。

图 5 PRIM1表达的Kaplan-Meier曲线

3 讨论与结论

Sine Oculis Homeobox Homolog 1(SIX1)表达的增加导致PRIM1等上调，促进了宫颈癌细胞的增殖和生长[32]；PRIM1失活通过S期停滞和Wee1介导的caspase8依赖的凋亡，使结直肠癌细胞对磷脂酰肌醇3激酶相关激酶ATR和CHK1激酶抑制剂敏感[33]；PRIM1受到血清雌二醇(E2)诱导的ER激活转录调节，靶向PRIM1蛋白表达显著降低ER+乳腺癌肿瘤细胞生长[9]。目前针对PRIM1的研究较少，其功能和作用机理有待进一步研究。

本研究中，我们阐述了PRIM1在多种类型癌中失调且在LIHC中高表达。基于临床病例特征进行亚组分析表明，PRIM1对所有亚型和不同种族的LIHC诊断有用，其可能是潜在的诊断和预后标志物有待临床验证。癌症进程伴随着基因组变异，PRIM1基因组发生的遗传改变，提示其可能在LIHC中具有潜在作用。对PRIM1相关的共表达基因进行GO和KEGG富集分析，有助于了解PRIM1在LIHC中参与的生物学过程和信号通路，为研究PRIM1在LIHC中的作用提供方向。分析预后因素有助于临床治疗的决策。研究表明，高表达PRIM1与较差的OS、PFS、RFS和DSS有关，可能是LIHC预后不良的预测指标，表明PRIM1表达水平可能是LIHC生存需要考虑的重要因素，值得进一步探究。我们的研究为理解PRIM1在LIHC中的潜在作用及其作为癌症生物标志物的应用提供了新视角。