大蒜素对肺腺癌细胞侵袭生物学行为影响的初步研究

宋圆红，黄 玲，顾俊菁

大蒜素对肺腺癌细胞侵袭生物学行为影响的初步研究

宋圆红，*黄 玲，顾俊菁

（井冈山大学附属医院，江西，吉安 343000）

通过MTT法、细胞粘附试验、Transwell细胞迁移和侵袭试验检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞的活性、粘附、迁移与侵袭能力的变化；(RT-qPCR) 逆转录-定量聚合酶链反应检测不同浓度的大蒜素对TIMP/MMP平衡的影响。本研究中发现大蒜素可呈剂量依赖性抑制肺腺癌细胞的活性、粘附、迁移和侵袭能力。大蒜素主要降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA水平，同时对于组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）的mRNA水平则相反地呈剂量依赖性增加。因此我们得出结论，大蒜素可能通过抑制TIMP/MMP平衡，从而抑制肺腺癌细胞的侵袭。大蒜素可作为肺腺癌治疗的潜在抗侵袭剂。

大蒜素； MMP-2；MMP-9；TIMP-1；TIMP-2；肺腺癌；侵袭

肺癌是发达国家和发展中国家癌症相关死亡的主要原因，而肺腺癌是肺癌最常见的组织学类型，约50%的肺癌为腺癌[1]。虽然手术、放疗、化疗等方面的管理和治疗有所改善，但其疗效不佳，其中最主要原因之一是缺乏对肺腺癌侵袭浸润的治疗策略[2-3]。因此，开发新的专门针对侵袭性进展的辅助治疗策略的研究至关重要。

侵袭发生是一个复杂的病理生理过程，涉及多个基因的改变[4-5]，基质金属蛋白酶(MMPs)，特别是MMP-2和MMP-9在癌变过程中起着非常重要的作用。在许多恶性肿瘤的侵袭过程是通过降解基底膜和细胞外基质实现的[6-8]。以往的研究表明MMP-2和MMP-9与肺癌的侵袭转移密切相关[4-5]。许多研究表明金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)可以调节MMPs的表达[6-9]。MMPs和TIMPs的平衡变化影响基质蛋白的重塑、形成和降解，诱导癌细胞的侵袭。

大蒜素，别名蒜素、蒜辣素，为三硫代烯丙醚类化合物，存在于百合科植物大蒜的鳞茎中[10]，有刺激性气味，并容易分解。大蒜素是大蒜的主要活性成分，具有多种抗肿瘤活性，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种治疗作用。已有研究表明，大蒜素能诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞周期、调节血管生成[11-14]。大蒜素的生物活性与多种机制有关，包括未折叠蛋白反应、p53介导的自噬、p38丝裂原活化蛋白激酶/caspase-3信号转导等[11-15]。而大蒜素在抑制肺腺癌侵袭中的作用报道较少。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

脂质体2000试剂和胎牛血清(FBS)是从Invitrogen Thermo Fisher科学公司购买。大蒜素是从圣克鲁斯生物技术公司购买。MTT从碧瑶生物技术研究所购买。抗-MMP-2、抗-MMP-9、抗-TIMP-1、抗-TIMP-2和抗β-actin是从圣克鲁斯生物技术公司购买。辣根过氧化物酶(HRP)-结合山羊抗兔(目录号ZDR-5307，1：2000稀释)和抗小鼠免疫球蛋白（目录号ZDR-5307，1：2000稀释)，从北京中山金桥生物技术有限公司获得。Transwell小室孔径8um。Matrigel(重建基底膜；BD生物科学)。

1.2 细胞株与细胞培养

两株肺腺癌细胞系A 549和H 1299是从中国科学院(上海)典型培养集细胞库购买的。在37˚C环境的Dulbecco改良Eagle培养基中加入10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，及含5%CO2的加湿环境中培养。

1.3 试验方法

1.3.1 MTT法

接种细胞到96孔板上，每孔104个细胞，在37˚C下孵育过夜，然后在不同浓度的大蒜素(0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μM）中孵育24 h。细胞培养中加入0.5 mg/mL MTT溶液，在37˚C孵育4 h后，加入二甲亚砜（0.5 mg/mL）终止反应，最后分光度法测量吸光度570 nm。

1.3.2 细胞粘附试验

A549和H1299细胞，用不同浓度的大蒜素（0、5.0、7.5、10.0 μM）在37˚C孵育48 h。在涂有5 mg/mL纤维连接蛋白，并用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭4 h制备96孔板。在37˚C下，1 h后将未附着的细胞用PBS洗掉，留下可附着在纤维连接蛋白涂层中的细胞，MTT法对附着的细胞测定贴壁细胞数。

1.3.3 Transwell细胞侵袭检测

采用6.5 mm Transwell小室（8 μm孔径）进行，过滤器是预先涂覆有1-2 mg/mL的Matrigel重建基底膜。细胞分别用0、5.0、7.5、10.0 μM不同浓度的大蒜素预处理。在100 μL无血清培养基上接种活细胞，将含有10%FBS的培养基添加到下腔作为趋化剂，在37 ˚C孵化24 h后，用棉签擦去上部的细胞，迁移到下室的细胞用甲醇固定，采用苏木精和伊红染色，并在光学显微镜下(放大倍数，x 200)随机对5个视野进行计数。

1.3.4 Transwell细胞迁移检测

细胞迁移试验如同细胞侵袭试验进行，但孵育时间较短，为12 h，并且没有包被Matrigel的基质胶涂层，并随机在5个视野中计数。

1.3.5 (RT-qPCR) 逆转录-定量聚合酶链反应

从H 1299细胞中提取总RNA，用TRIzol在不同浓度的大蒜素（0、5.0、7.5、10.0 μM），cDNA合成RT-qPCR。人MMP-2的引物(前向，5‘-GGT TGT CTG AAG TCA CTG CAC AGT-3’和反向，5‘-CTC GGT agg GAC GATG CTA) GT AGA G-3‘，MMP-9(前向，5’-GCT GGG CTT AGA TCA TTC CTC A-3‘和反向，5’-CTG GCG CAA AAG A-3‘)，TIMP-1(前向，5’-gag AAC TGG CCC-3‘和反向，5’-TAT CAG CCA CAG CAA-3‘) CAG-3‘，TIMP-2(前向，5’-CCA CCC AGA GCC TG-3‘和反向，5’-CAG CGC GTG ATC TTG CAC-3‘)和GAPDH(前向，5’-CCT CCC GCT TCG CTC TCT-3‘和反向，5’-CTG GCG ACG CAAG A-3‘) 采用RT-qPCR方法。

1.4 统计学分析

每个实验至少重复3次，数据表示为平均数±标准差。采用SPSS16.0统计软件和t检验进行统计分析。< 0.05则表明差异有统计学意义。

2 实验结果与分析

2.1 MTT法检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞A 549和H 1299细胞活性的影响研究

首先用细胞活力法检测大蒜素对A549和H1299肺腺癌细胞的细胞活性，大蒜素浓度有0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μM，如图1所示，A 549和H 1299细胞经15 μM和20.0 μM大蒜素处理后，细胞活性明显降低（＜0.05）。但是，当大蒜素浓度低于15 μM时，肺腺癌细胞的活性没有明显下降。因此，我们选择大蒜素<15.0 μM的浓度范围进行后续实验，以排除细胞毒性对细胞侵袭的影响。

图1 MTT法测定不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞活性的影响

*与对照组比较，差异有显著性（< 0.05）

2.2 细胞粘附试验、Transwell细胞迁移和侵袭试验检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭能力的影响研究

首先，测试了A 549和H 1299肺腺癌细胞与不同浓度的大蒜素孵育后细胞粘附能力的变化。试验结果表明，A549在大蒜素7.5、10 μm时，而H1299在大蒜素5.0、7.5、10 μm 时以浓度依赖性方式，降低肿瘤细胞对纤维连接蛋白的粘附作用（如图2 A及B)。其次，观察了不同浓度的大蒜素对A 549和H 1299细胞迁移和侵袭能力的影响，细胞在大蒜素5.0、7.5、10 μm作用下迁移或侵袭的肺腺癌细胞数量呈剂量依赖性减少(如图2C及D)。上述数据表明，大蒜素抑制了肺腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭能力。

图2 细胞粘附试验、Transwell迁移和侵袭试验检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞粘附、迁移和侵袭能力的影响

*与对照组比较，差异有显著性（< 0.05）

2.3 RT-qPCR从分子水平检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞TIMP/MMP平衡的影响研究

以往的研究表明，MMPs的表达受内源性组织抑制剂(TIMPs)的调控[7-9]。采用RT-qPCR方法检测了0，5.0、7.5、10.0 μM大蒜素对H 1299作用48 h后，检测肺腺癌细胞MMP-2和MMP-9的mRNA水平（图3A），以及肺腺癌细胞TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平（图3B）。发现大蒜素以浓度依赖性的方式上调了H 1299细胞中TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平（图3B），而大蒜素剂量依赖性地抑制了H 1299细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平（图3A）。这些结果表明，大蒜素通过对TIMP/MMP的平衡的调节，从而影响了肺腺癌细胞的粘附、迁移与侵袭能力。

图3 RT-PCR检测不同浓度的大蒜素对肺腺癌细胞的TIMP/MMP平衡的调节影响

*与对照组比较，差异有显著性（< 0.05）

3 讨论

癌细胞的异常侵袭被认为是癌症的重要生物学特征。浸润的存在是肺癌患者复发和死亡的主要原因[1,16]。本研究发现大蒜素能抑制肺腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭。它还提供了证据表明，上述影响背后的机制与改变TIMP/MMP平衡有关[17]。本研究为探讨大蒜素在肺腺癌侵袭中的作用提供了理论依据。

越来越多的研究表明，大蒜素对胶质瘤U87、肝癌G2和胃癌MGC 803细胞[12-14]具有细胞毒作用。这些大蒜素的特性使其成为一种很有前途的抗肺腺癌抑制剂。在本研究中，我们发现大蒜素可以抑制细胞活力，提示大蒜素对肺腺癌具有细胞毒性作用。据我们所知，关于这种关注大蒜素和癌细胞的侵袭的研究很少。为此，我们还分析了大蒜素在肺腺癌细胞侵袭中的作用，研究显示大蒜素抑制肺腺癌的侵袭性与肺腺癌细胞粘附、迁移和侵袭浸润减少有关。有研究显示MMP-1与TIMP-1之间平衡失调可促进肝脏纤维化病变[18]，显示基质金属蛋白酶，特别是MMP-2和MMP-9，控制细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，而通常情况下，TIMPs与MMPs结合，使它们的活动处于动态状态。然而，一旦这种平衡被打破，癌细胞的侵袭和转移就可被诱导[6-9]。TIMPs和MMPs之间的不平衡被认为是促进肺癌的侵袭过程主要机制。

Hu等人报道，缺氧可能是通过调节MMP-9和TIMP-2的表达[19]而影响肺癌细胞的侵袭性。Ylisirnio等人证明血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 与肺癌患者的临床结果，可作为预后指标[20]。已经证实MMP，特别是MMP-2和MMP-9参与了肺癌的侵袭。探讨观察大蒜素对MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2表达的影响。结果表明，大蒜素剂量依赖性地下调了MMP-2和MMP-9的mRNA水平，而TIMP-1和TIMP-2 mRNA水平呈剂量依赖性增加[21]。大蒜素抑制肺腺癌细胞的活性、粘附、迁移和侵袭。这些数据表明，大蒜素可能通过诱导基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)与TIMPs(TIMP-1和TIMP-2)之间的相互作用，使两者表达失衡从而抑制肺腺癌的侵袭。

有研究表明大蒜素能调控 VEGF/PI3K/AKt抑制卵巢癌 SKOV3 细胞的增殖和生长，促进细胞凋亡，且具有时间—剂量反应关系[22]。也有研究证实PI3K/AKT通路在乳腺癌、垂体腺瘤和前列腺癌[23-25]等多种肿瘤中被激活。有研究显示C-met及COX-2两者可成为肺癌的早期诊断、早期预后评估的标志物[26]，PI3K/AKT信号通路可能通过调节MMP和TIMPs的表达来促进ECM蛋白的降解，这一机制对肿瘤的侵袭是必不可少的，包括肺癌。据我们研究所知，大蒜素已被证实可抑制HepG 2细胞中的PI3K/AKT信号通路。而大蒜素抑制肺腺癌细胞侵袭是否也是通过PI3K/AKT信号通路起作用，我们拟通过后续实验来证实。

总之，我们的研究数据表明，大蒜素通过改变TIMP/MMP平衡来抑制肺腺癌细胞的侵袭，大蒜素可作为潜在的肺腺癌治疗的抗侵袭剂。

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A preliminary study of the effect of allicin on the invasive biological behavior of lung adenocarcinoma cells

SONG Yuan-hong,*HUANG Ling, GU Jun-jing

（Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China）

MTT method, cell adhesion test, Transwell cell migration and invasion test were used to detect the changes in the activation, adhesion, migration and invasion of lung adenocarcinoma cells at different concentrations of allicin; (RT-qPCR) reverse transcription-quantitative polymerization enzyme chain reaction was used to detect the influence of different concentrations of allicin on the balance of TIMP/MMP. It was found that allicin could inhibit the activation, adhesion, migration and invasion of lung adenocarcinoma cells in a dose-dependent manner. Allicin mainly reduced the mRNA levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and at the same time for tissue metalloproteinase inhibitor-1 (TIMP-1) and tissue metalloproteinase inhibitor- 2 (TIMP-2) mRNA levels increased in a dose-dependent manner on the contrary. It could be concluded that allicin may inhibit the invasion of lung adenocarcinoma cells by inhibiting the balance of TIMP/MMP. Allicin could be used as a potential anti-invasive agent in the treatment of lung adenocarcinoma.

allicin; MMP-2; MMP-9; TIMP-1; TIMP-2; lung adenocarcinoma; invasion

1674-8085（2022）01-0052-05

R734.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.01.009

2021-09-09；

2021-10-16

国家自然科学基金项目（81860282）；江西省中医药管理局科技计划项目(2020A0383)

宋圆红(1985-)，女，江西吉安人，主治医师，硕士，主要从事病理诊断学研究(E-mail: 1491697599@qq.com)；

*黄 玲(1984-)，男，江西吉安人，副主任医师，博士，主要从事胸心血管外科和肿瘤研究(E-mail: hzh_0796@163.com）.