横经席提取物降血脂功效评价的实验研究

蒙永明 吕林艳 朱运锐 黄源春 梁云飞 郑志远

横经席提取物降血脂功效评价的实验研究

蒙永明1,2吕林艳1,2朱运锐1,2黄源春1,2梁云飞1,2郑志远1,2

（1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000；2.广西药物提纯工程技术研究中心，广西 梧州 543000）

目的：研究和评价横经席提取物的降血脂功效。方法：建立高血脂斑马鱼模型，制备横经席根茎、枝叶和种子的提取物，并以高、中、低三种浓度分别处理高血脂斑马鱼，观察和比较横经席不同部位提取物对高血脂斑马鱼甘油三脂、胆固醇、血流速度和血管壁厚度的影响。结果：横经席根茎、枝叶和种子的提取物均能降低高血脂斑马鱼的甘油三酯水平和胆固醇水平，并改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度异常。结论：横经席提取物对实验的动物模型具有降血脂功效。

横经席提取物；降血脂；功效评价

引言

横经席，又名薄叶红厚壳、跌打将军、独角风等，其植株多个部位含有香豆素类、呫吨酮类、黄酮类、萜类等多种类化合物[1]，药用前景广阔，具有祛风湿、强筋骨、止痛、治疗跌打损伤等功效。已有文献公开了横经席的抗炎镇痛作用，并且验证了其急性与毒性小的特点[2]。

横经席的种植周期长，多数源自于野生采摘[3]。随着市场需求的增长，横经席药材资源的供给相对紧张。鉴于横经席药材的珍贵，如何进一步开发更多的药用功能、实现横经席药材资源的综合利用，是需要探讨的技术问题。有关横经席的药效学研究并不多见，目前未见有横经席其他药用用途的报道。本文通过建立高血脂斑马鱼模型来开展实验，观察比较横经席根茎、枝叶和种子的提取物对高血脂斑马鱼甘油三脂、胆固醇、血流速度和血管壁厚度的影响，以评价横经席提取物的降血脂功效。

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后5天（5 dpf）的斑马鱼用于降血脂功效最大检测浓度（maximum test concentration，MTC）测定及其功效评价。转基因血管绿色荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后5天（5 dpf）的斑马鱼用于改善血管壁厚度功效评价。

以上所述的实验用斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450 μS·cm-1～550 μS·cm-1；pH为6.5～8.5；硬度为50 mg·L-1～100 mg·L-1CaCO3），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。

1.2 实验仪器、耗材与试剂

解剖显微镜（SZX7，日本OLYMPUS公司）；显微注射仪（IM300，日本Narishige公司）；拉针仪（PC-10，日本Narishige公司）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，日本Nikon公司）；精密电子天平（CP214，美国OHAUS公司）；6孔板（中国Nest Biotech公司）；心跳血流分析系统（ZebraBlood 3.4，法国ViewPoint Life Sciences公司）；激光共聚焦显微镜（A1R，日本Nikon公司）。

二甲基亚砜（DMSO，批号BCCD8942，瑞士Sigma公司）；甲基纤维素（批号B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胆固醇探针CholEsteryl BODIPY™542/563 C11（批号2291600，美国invitrogen公司）；油红O（批号SHBM5455，美国Sigma公司）；1.2-丙二醇（批号20211117，国药集团化学试剂有限公司）；纯蛋黄粉（批号20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-(+)-葡萄糖（批号20201105，国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 药物制备

取横经席根茎、枝叶和种子分别粉碎，各自称取10 g所得药粉加入50 mL纯化水提取，保持微沸30 min，过滤，药渣加入20 mL～30 mL纯化水继续提取，保持微沸20 min，再次过滤，合并两次提取液，然后加入纯化水定量至50 mL，即得含量为0.2 g·mL-1（每毫升提取液相当于0.2 g生药）的横经席提取物，以此作为样品母液，并于-20 ℃分装储存，使用时稀释。

阳性对照药物：阿托伐他汀钙片（以下简称阿托伐他汀钙），白色片剂，批号202105219C，乐普医疗，阴凉避光储存。用DMSO配制成11.6 mg·mL-1母液，-20 ℃分装储存，使用时稀释。

2 实验方法

2.1 MTC测定

随机选取5 dpf黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于烧杯中，每烧杯30尾。分别水溶给予横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子提取物高、中、低三种浓度的样品溶液，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为25 mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料（纯蛋黄粉+葡萄糖）喂饲斑马鱼，建立斑马鱼高血脂模型。样品与高脂饲料共同处理15 h（每天共同处理7.5 h）。在样品处理期间，每天需统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。28 ℃处理48 h后，测定横经席样品对高血脂模型斑马鱼的MTC。

2.2 降甘油三酯功效评价

斑马鱼高血脂模型建立如“2.1”节所述，增加阳性对照阿托伐他汀钙11.6 μg·mL-1浓度，样品与高脂饲料共同处理15 h（每天共同处理7.5 h）。28 ℃处理48 h后，给予油红O进行整体脂肪染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管染色强度，以该指标的统计学分析结果评价横经席样品降甘油三酯功效。

2.3 降胆固醇功效评价

斑马鱼高血脂模型建立如“2.1”节所述，增加阳性对照阿托伐他汀钙11.6 μg·mL-1浓度，样品与高脂饲料共同处理15 h（每天共同处理7.5 h）。28 ℃处理32 h时，注射胆固醇探针。继续处理16 h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价横经席样品降胆固醇功效。

2.4 改善高血脂血流功效评价

斑马鱼高血脂模型建立如“2.1”节所述，增加阳性对照阿托伐他汀钙11.6 μg·mL-1浓度，样品与高脂饲料共同处理15 h（每天共同处理7.5 h）。28 ℃处理48 h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析统计斑马鱼血流速度，以该指标的统计学分析结果评价横经席样品改善高血脂血流功效。

2.5 改善血管壁厚度功效评价

随机选取5 dpf转基因血管绿色荧光斑马鱼于烧杯中，每烧杯30尾。分别水溶给予横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子高、中、低三种浓度的样品溶液，阳性对照阿托伐他汀钙11.6 μg·mL-1浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为25 mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料，建立斑马鱼高血脂模型。样品与高脂饲料共同处理15 h（每天共同处理7.5 h）。28 ℃处理48 h后，每个实验组随机选取3尾斑马鱼置于激光共聚焦显微镜下拍照，以斑马鱼眼部血管壁厚度定性评价横经席样品改善血管壁厚度功效。

2.6 数据处理

实验数据结果均采用（均数±标准差，`c±SD）表示，运用SPSS 26.0软件进行统计学分析，＜0.05表明差异具有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 MTC

从表1可看出，当横经席根茎提取物和横经席枝叶提取物浓度均为250 μg·mL-1时，斑马鱼的表型较模型对照组状态均开始严重。因此在本实验条件下，横经席根茎和横经席枝叶降血脂功效的MTC均为125 μg·mL-1，横经席种子降血脂功效的MTC为2000 μg·mL-1。

表1 横经席样品降血脂功效浓度摸索实验结果（n = 30）

3.2 降甘油三酯功效评价

斑马鱼的血脂构成、脂质吸收和代谢与人类高度一致。实验中采用高脂食物（纯蛋黄粉+葡萄糖）喂饲斑马鱼，使斑马鱼血浆中的脂肪含量快速升高[4]。研究表明，碳水化合物、脂质、凝血因子等平衡的改变，可造成血管内皮损伤、红细胞聚集（变形能力受损）及血小板异常粘附，进而造成甘油三酯和胆固醇在血管壁沉积、炎症细胞渗出和迁移、血流动力学改变等，最终引起组织、器官坏死[5]。油红O是一种强脂溶剂和染脂剂，可特异性地与甘油三酯等中性脂肪结合而呈橘红色，该显色反应常用于甘油三酯染色和定量评价[6]。在图1的分析部位示意图中，本实验选取箭头所指的斑马鱼尾部静脉作为分析部位。

如表2和图1所示，在本实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组尾部静脉甘油三酯染色强度显著增加，具有统计学差异（＜0.001），表明模型建立成功；与模型对照组比较，阳性药阿托伐他汀钙可显著降低尾部静脉甘油三酯染色强度，具有统计学差异（＜0.001）；横经席根茎125 μg·mL-1浓度组尾部静脉甘油三酯染色强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（＜0.001）；横经席枝叶31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1浓度组的尾部静脉甘油三酯染色强度均较模型对照组降低，具有统计学差异（＜0.05 &＜0.01 &＜0.01）；横经席种子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1浓度组尾部静脉甘油三酯染色强度较模型对照组降低，具有统计学差异（均＜0.05）。

降甘油三酯功效评价中，三个横经席样品同浓度比较：（1）在31.2 μg·mL-1条件下，横经席枝叶尾部静脉甘油三酯染色强度显著低于横经席根茎（＜0.01）；（2）在62.5 μg·mL-1条件下，横经席枝叶尾部静脉甘油三酯染色强度显著低于横经席根茎（＜0.05）；（3）在125 μg·mL-1条件下，甘油三酯染色强度无显著差异，但横经席根茎尾部静脉甘油三酯染色强度绝对值低于横经席枝叶。由于尾部静脉甘油三酯染色强度越低则降甘油三酯功效越佳，因此，本实验提示横经席枝叶的降甘油三酯功效最优，横经席根茎次之。

表2 横经席样品降甘油三酯功效评价实验结果（`c±SD，n = 10）

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

图1 横经席样品处理后斑马鱼尾部静脉甘油三酯染色强度典型图

3.3 降胆固醇功效评价

胆固醇荧光探针CholEsteryl BODIPY™542/563 C11专门与胆固醇亲和，在细胞中进行运输和代谢，是有效的脂质运输示踪剂，其荧光强弱与血中胆固醇的含量高低成正比关系[7]。本实验选取同“3.2”节所述斑马鱼尾部静脉作为分析部位。

如表3所示，在本实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组尾部静脉胆固醇荧光强度显著增加，具有统计学差异（＜0.001），表明模型建立成功；与模型对照组比较，阳性药阿托伐他汀钙可以显著降低尾部静脉胆固醇荧光强度，具有统计学差异（＜0.01）；横经席根茎125 μg·mL-1浓度组的尾部静脉胆固醇荧光强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（＜0.001）；横经席枝叶125 μg·mL-1浓度组尾部静脉胆固醇荧光强度较模型对照组降低，具有统计学差异（＜0.05）；横经席种子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1浓度组尾部静脉胆固醇荧光强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（＜0.01 &＜0.001）。

降胆固醇功效评价中，三个横经席样品同浓度比较：（1）在31.2 μg·mL-1条件下，横经席枝叶尾部的静脉胆固醇荧光强度显著低于横经席根茎（＜0.05）；（2）在62.5 μg·mL-1条件下，横经席根茎尾部的静脉胆固醇荧光强度绝对值与横经席枝叶相似，无显著差异；（3）在125 μg·mL-1条件下，胆固醇荧光强度无显著差异，但横经席根茎尾部静脉胆固醇荧光强度绝对值低于横经席枝叶。因为尾部静脉胆固醇荧光强度越低则降胆固醇的功效越佳，故本实验提示降胆固醇功效横经席根茎最优，横经席枝叶次之。

表3 横经席样品降胆固醇功效评价实验结果（`c±SD，n = 10）

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.4 改善高血脂血流功效评价

如表4所示，在本实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组血流速度显著降低，具有统计学差异（＜0.001），表明模型建立成功；与模型对照组比较，阳性药阿托伐他汀钙可以显著增加血流速度，具有统计学差异（＜0.01）；横经席根茎62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1浓度组血流速度较模型对照组显著增加，具有统计学差异（均＜0.001）；横经席枝叶31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1浓度组血流速度较模型对照组增加，具有统计学差异（＜0.05 &＜0.05 &＜0.001）；横经席种子500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1浓度组血流速度较模型对照组显著增加，具有统计学差异（均＜0.001）。

在改善高血脂血流功效中，三个横经席样品同浓度比较情况如下：（1）在31.2 μg·mL-1条件下，血流速度无显著差异，但横经席枝叶血流速度绝对值高于横经席根茎；（2）在62.5 μg·mL-1条件下，横经席根茎血流速度显著高于横经席枝叶（＜0.001）；（3）在125 μg·mL-1条件下，血流速度无显著差异，但横经席根茎血流速度绝对值高于横经席枝叶。血流速度越高，则改善高血脂血流功效越佳，因而本实验提示改善高血脂血流功效横经席枝叶最优，横经席根茎次之。

表4 横经席样品改善高血脂血流功效评价实验结果（`c±SD，n = 10）

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.5 改善血管壁厚度功效评价

实验中选取图2箭头所指区域作为横经席样品处理后斑马鱼眼部血管壁厚度分析部位。如图3所示，与正常对照组比较，模型对照组的血管壁厚（即图中亮区）明显增大。与模型对照组比较，阳性药阿托伐他汀钙可以显著改善血管壁的厚度。观察图3结果可知，经横经席样品处理后的斑马鱼眼部血管内的亮区区域显著缩小，因此在本实验条件下，横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子均具有改善血管壁厚度的功效。

图2 横经席样品处理后斑马鱼眼部血管壁厚度分析部位示意图

图3 横经席样品处理后斑马鱼眼部血管典型图

4 结论

综上所述，在本实验条件下，横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子均具有降血脂功效，具体表现为降甘油三酯水平、降胆固醇水平、改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度异常。结合降甘油三酯功效、降胆固醇功效和改善高血脂血流功效评价的实验结果，提示横经席枝叶的降血脂功效最优，横经席根茎次之。

本文提供了一种横经席提取物的制备方法，并通过建立高血脂斑马鱼模型评价了横经席的降血脂功效，为进一步开发和利用横经席中药材提供了可行途径。

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Experimental Study on the Evaluation for Hypolipidemic Effect of Calophylli Herba Extracts

Objective: To study and evaluate the hypolipidemic effect of Calophylli herba extracts. Methods: A hyperlipidemic zebrafish model was established and the extracts of the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba were prepared. The hyperlipidemic zebrafish were treated with high, medium and low concentrations respectively. The effects of the extracts from different parts of the Calophylli herba on the triglyceride, cholesterol, blood flow velocity and vessel wall thickness of the hyperlipidemic zebrafish were observed and compared. Results: The extracts from the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba can reduce the triglycerides level and cholesterol level of hyperlipidemic zebrafish, and improve the abnormal blood flow velocity and vessel wall thickness caused by hyperlipidemia. Conclusion: The extracts of Calophylli herba have hypolipidemic effect in the experimental animal models.

Calophylli herba extracts; hypolipidemic; effect evaluation

R282

A

1008-1151(2022)12-0119-05

2022-09-21

梧州市科技计划项目（2022A04021）。

蒙永明（1987－），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司工程师，从事药用材料研究相关工作。

郑志远（1967－），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司高级工程师，从事药物研究相关工作。