组蛋白H3K79 甲基化转移酶DOT1L 的功能研究进展

陈晓晴，陈亮

（武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072）

组蛋白的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）是细胞调控染色质功能的常见表观遗传机制之一，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等.这些PTM 可以通过改变染色质结构或招募相应下游功能蛋白来影响基因表达、DNA 复制等染色质活动.其中，组蛋白甲基化是以S-腺苷-L-蛋氨酸（S-Adenosyl methionine，SAM）作为供体，由组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT）将1 个、2 个或3 个甲基转移到组蛋白的赖氨酸或精氨酸残基的过程.

Dot1（disruptor of telomeric silencing 1，也称为KMT4）首次在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因筛选中被发现，当其过表达时会导致端粒沉默缺陷.在哺乳动物中，Dot1 保守的同源蛋白是DOT1L（Dot1-like），该酶被认为是组蛋白H3 赖氨酸79 的唯一催化酶，能使H3K79 发生单甲基化、二甲基化和三甲基化[1].通常，将DOT1L 介导的H3K79 甲基化与活跃基因转录联系起来.最近研究显示，DOT1L参与调控细胞周期进程和免疫应答反应，在生物体多种组织或器官发育中具有必不可少的作用，而其异常调控则与肿瘤发生与发展（如MLL基因重排白血病）密切相关.目前，针对DOT1L 开发的小分子抑制剂已在癌症的早期临床实验中取得初步结果.

1 DOT1L 的催化活性及其调控机制

2002 年，Feng[2]等首次在人细胞中鉴定出DOT1L 蛋白，该蛋白在体外和体内具有组蛋白甲基转移酶活性，能特异性催化组蛋白H3K79 位点的单、二或三甲基化修饰.2003 年，Min[3]等通过X 射线晶体衍射法解析出DOT1L 位于1-416 氨基酸残基的催化结构域结构，包括碳和氮末端结构域.两者通过碳末端的长α螺旋和氮末端的氨基酸残基发生相互作用.

此外，Worden[4]等发现DOT1L 对底物核小体而非核心组蛋白或重组组蛋白H3 具有酶催化活性，表明DOT1L 催化H3K79 甲基化需其他组蛋白参与.在人类细胞中，DOT1L 催化功能依赖组蛋白H2B 赖氨酸120（H2BK120）的单泛素化，H2BK120 的突变导致H3K79 甲基化水平显著下降.此外，组蛋白H4 氮末端的短碱性口袋与DOT1L 酸性口袋间的相互作用也为H3K79 甲基化所必需.2019 年，Worden[4]等通过冷冻电镜技术解析了组蛋白H2B 泛素化和H4 尾部与DOT1L 催化H3K79 甲基化的动态过程.DOT1L 与H2B-Ub核小体和SAM 的结合存在2 种不同状态，暂停或活跃状态.在暂停状态下，H2B 泛素分子和由组蛋白H2A、H2B 形成的核小体酸性口袋与DOT1L 碳端结合，将DOT1L 碳端锚定在核小体上，而DOT1L 氮端处于动态无序状态，导致DOT1L 的活性位点距离H3K79 过远.在活跃状态下，DOT1L 氮端的沟槽和H4 尾部的碱性残基（15-19）结合，将DOT1L 氮端固定在核小体另一端，最终使DOT1L 及其催化中心准确定位在H3K79上方，保证该残基的识别特异性.活跃状态下的DOT1L 促进核小体内部H3K79 正亮氨酸环发生约90°旋转，远离核小体表面并暴露H3K79 位点于DOT1L 催化中心.

除了H3K79，DOT1L 还催化其他底物，如前列腺癌中雄激素受体（androgen receptor，AR）K349 位的甲基化[5].

2 DOT1L 的生物学功能

2.1 DOT1L 与转录调控

通常，认为真核生物H3K79 甲基化与基因活跃转录相关.在人CD4+T 细胞中，染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-Seq）显示H3K79me2/me3 与基因活性呈正相关.在小鼠细胞中，H3K79 甲基化被发现定位在活跃转录基因体内，且其富集水平与基因表达水平正相关[6].相反地，在小鼠肾脏中，Reisenauer[7]等发现编码上皮Na+通道亚基的αENaC基因表达被H3K79 甲基化抑制.DOT1L 缺失影响基因表达，且大部分基因显示表达上调，但这些影响源于DOT1L 蛋白自身还是H3K79甲基化修饰，是直接还是间接调控目前尚无定论.

最近研究显示，DOT1L 与人类细胞中的转录延伸存在相关性.DOT1L 与RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，RNAPII）碳末端重复结构域（C-terminal domain，CTD）、超延伸复合物（super elongation complex，SEC）亚基ENL、AF4、AF9、AF10 发生相互作用.RNAPII CTD 的Ser5 和Ser2 磷酸化修饰分别对应RNAPII 在启动子起始转录和进入有效转录延伸阶段.SEC 可以通过磷酸化RNAPII CTD 调控RNAPII 从基因启动子近端暂停位点释放进入转录延伸.另外，ENL 的敲低降低了全基因组H3K79me2 水平及转录延伸活性[8]49-50，这些证据暗示DOT1L 在转录延伸中的作用.通过BruDRB-seq 测量全基因组转录延伸速率发现，转录起始区的H3K79me2 水平与转录延伸速率正相关[9].DOT1L 调控特定基因的转录延伸可能不依赖H3K79 甲基化，因为突变DOT1L 催化活性位点未观察到转录延伸速率的改变[10].DOT1L/H3K79 甲基化修饰对转录延伸的作用及机制有待进一步研究.

2.2 DOT1L 在细胞周期调控中的作用

细胞周期是单向且不可逆的过程，确保细胞分裂的正常进行.研究发现，DOT1L 参与调控哺乳动物细胞周期转换.在人肺癌细胞和小鼠卵黄囊衍生的红系祖细胞中，DOT1L 敲低或缺失会导致G1 期阻滞[11-12].在体外分化的小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）中，DOT1L 缺失引起细胞增殖缺陷并阻滞在G2/M期[13].在结直肠癌细胞中，DOT1L 沉默或抑制则诱导细胞S 期阻滞[14].DOT1L 敲低或缺失造成不同细胞的差异影响可能与细胞周期中H3K79 甲基化水平相关.如在小鼠ESC 中，G1/S 转换期H3K79 甲基化水平变化不大，但在人肺癌细胞中H3K79me2 水平明显升高，这暗示DOT1L 可能通过H3K79me2 调控肺癌细胞G1/S 期转换[15].此外，尽管H3K79 甲基化的整体水平在细胞周期中没有波动，但其在特定染色质区域的局部水平变化也可能是细胞周期调控差异的原因.

DNA 损伤引发细胞周期停滞，相应的DNA 修复机制被启动以确保细胞周期进程的顺利进行.DOT1L及其介导的H3K79 甲基化参与DNA 损伤修复过程.2004 年，Huyen[16]等发现人DNA 双链断裂（DNA double-strand break，DSB）修复蛋白53BP1 与H3K79me2 结合并被招募到DSB 处，H3K79 位点的突变、DOT1L 的缺失以及53BP1tudor 结构域的突变都抑制了53BP1 向DSB 的募集.此外，DOT1L 也在紫外线辐射（ultraviolet，UV）引发的DNA 损伤修复及烷化剂引起的跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）修复中发挥重要作用[8，17].鉴于DOT1L/H3K79 甲基化修饰与转录活动密切相关，其在DNA 损伤修复中的作用是否有转录活动参与值得未来研究.

2.3 DOT1L 在免疫应答中的作用

最新多项研究显示，DOT1L 调控免疫系统T 淋巴细胞的分化和功能.在条件性敲除T 淋巴细胞DOT1L的小鼠模型中，Scheer[18]等发现胸腺和脾脏中的CD4+T 细胞数量显著减少，且细胞凋亡增加.此外，DOT1L缺失还激活T 细胞受体（TCR）信号传导通路，降低TCR 负调节因子CD5 的表达，促进CD4+T 细胞的活化.初始CD4+T 细胞在遇到抗原后可以分化成不同的T 辅助（T helper，Th）细胞亚群，包括产生干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的Th1 细胞、产生白细胞介素（interleukin，IL）-4/5/13 的Th2 细胞和产生IL-17的Th17 细胞.敲除DOT1L 导致CD4+T 细胞中IFN-γ表达升高，产生这种结果是因为DOT1L 缺陷型Th2和Th17 细胞重编程为表达Th1 相关基因（IFN-γ）的细胞.另外，在抑制Th1 分化的转录因子基因上发现H3K79me2 水平下降.这些证据表明，DOT1L 可能通过抑制Th1 基因和激活负调节因子来控制Th1 分化.DOT1L 缺失会损害体内Th2 反应，暗示DOT1L 抑制剂在治疗Th2 导致的过敏性疾病中的可行策略.

DOT1L 在B 淋巴细胞介导的体液免疫反应中也具重要作用.Kealy[19]等发现，敲除B 细胞的DOT1L，小鼠骨髓和脾脏B 细胞数量减少.此外，特异性敲除成熟B 细胞的DOT1L 会导致流感病毒感染后的记忆B 细胞缺失以及骨髓浆细胞减少.研究表明，DOT1L 为生发中心（germinal center，GC）形成和产生有效GC 反应所必需.在流感病毒感染后，DOT1L 缺陷下调B 细胞信号传导和迁移相关基因的表达，导致活化的BCL6+B 细胞未能定位在卵泡内形成GC，产生偏向于Th1 细胞的IgG1 或Th2 细胞的IgG2c 抗体明显减少[20].总之，这些结果显示DOT1L 是体液免疫反应的调控蛋白.

除了调控T 和B 淋巴细胞的功能，DOT1L 还被报道参与流感病毒感染后的抗病毒反应.Marcos-Villar[21]等发现，敲低DOT1L 或抑制其酶活性损害了核因子NF-κB 入核，下调NF-κB 诱导的IFNβ、IFN 刺激基因56（ISG56）和干扰素诱导蛋白Mx1表达，最终促进流感病毒复制.DOT1L 对病毒复制的影响依赖IFN 信号传导通路，因为DOT1L 抑制干扰素诱导病毒（如水疱性口炎病毒）增殖，但不改变非干扰素诱导的呼吸道合胞病毒扩增[22].这些证据支持DOT1L 或H3K79 甲基化在调节干扰素诱导病原体抗病毒反应中的作用.

2.4 DOT1L 在机体发育中的作用

DOT1L 在心脏和血管生成中发挥重要作用，DOT1L 缺失会导致胚胎死亡和心血管缺陷.Nguyen[23]等发现，特异性敲除小鼠心脏DOT1L 引起抗肌萎缩蛋白基因下调，出现心室扩张和收缩障碍.此外，有研究表明，DOT1L 通过与转录因子ETS-1 协同作用刺激基因Vegfr2表达，促进血管生成[24].DOT1L 在红细胞生成方面也有重要作用，DOT1L 敲除的小鼠胚胎表现严重贫血和骨髓细胞不足.DOT1L 促进红细胞分化可能通过激活Gata2和抑制骨髓转录因子PU.1 实现[12]4488-4489.研究发现，DOT1L 在小鼠软骨形成过程中高表达，在小鼠软骨细胞中敲低DOT1L 会导致软骨形成受损.另外，在敲低细胞中Wnt 靶基因表达下调，显示DOT1L 可能通过调控Wnt 信号通路促进软骨形成[25].DOT1L 是淋巴管发育和功能的调节蛋白，Tie2（+）内皮细胞（endothelial cells，ECs）中DOT1L 的缺失下调H3K79me2 水平并抑制与发育和组织功能相关的重要基因表达，引起皮肤水肿、血液-淋巴混合、淋巴瓣和血管发育不全[26].综上，DOT1L 在维持机体正常发育中具有重要作用，提示运用DOT1L 抑制剂治疗时可能出现发育相关的并发症.

3 DOT1L 与MLL-r 白血病

急性白血病是最常见的癌症之一，也是儿童癌症死亡的主要原因.急性白血病主要包括急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病，染色体易位是导致2 种白血病发展的主要机制之一，最常见的是混合谱系白血病基因（Mixed Lineage Leukemia，MLL）易位.MLL基因的易位重排导致MLL 氮端与多种融合伴侣（>90个）碳端融合，产生的融合蛋白与DNA 或染色质结合，并在造血干细胞和祖细胞中诱导白血病转化.研究发现，DOT1L 及其介导的H3K79me2 在MLL-r 白血病中发挥重要作用.DOT1L 通过与MLL 融合蛋白（如MLL-AF4，MLL-AF9，MLL-AF10，MLL-ENL）直接或间接作用，被异常招募至MLL 融合靶基因（如Hoxa家族和Meis1）启动子处，随后DOT1L 催化的H3K79me2 激活这些基因的转录，促进白血病转化.DOT1L的催化活性是MLL重排白血病发生的驱动因素，因为DOT1L 的酶活缺陷能够抑制MLL-r 细胞的生长.尽管DOT1L 在疾病本身中没有发生基因突变，但其错误定位的酶活性是致使MLL-r 患者发病的原因之一，这意味着DOT1L 酶活可以作为白血病治疗的靶标[27].据此研发出DOT1L 的小分子抑制剂EPZ004777，该化合物通过与DOT1L 甲基转移酶活性所需的SAM 辅助因子竞争而发挥作用.EPZ004777 能有效抑制细胞H3K79 甲基化，阻断白血病基因表达并选择性杀死MLL-r 细胞，但其药理特性较差.第二代SAM 竞争型抑制剂EPZ5676 是EPZ004777 的衍生药物，具有更高的底物特异性和效能，目前该药处于临床实验中，但其口服的生物利用率较低，需要腹腔给药.最近，开发出了新的高效小分子抑制剂SGC0946 和SYC-522，这些药物正在进行功能和作用机制的研究中[28].此外，一些针对DOT1L 通路的替代药物和联合用药方案也在积极探索中.

4 展望

近年来，因DOT1L 与各种肿瘤的发生、发展密切相关，逐渐成为癌症预后评估和治疗干预的潜在靶点，特别是MLL-r 白血病.目前，已经开发出用以治疗MLL-r 白血病的DOT1L 抑制剂，但这些抑制剂普遍存在生物利用率低和快速降解等问题.此外，DOT1L 对机体发育的重要作用也提示靶向DOT1L 的治疗方法存在副作用风险.因此，深入探索DOT1L 在不同发育过程和疾病中的作用机制，将有助于开发新的治疗方案，如靶向DOT1L 调控蛋白或下游效应蛋白，达到更优的治疗效果.