外泌体在移植物抗宿主病中的作用及其miRNA作为生物标志物①

刘信如 沈佐君 （中国科学技术大学附属第一医院检验科，合肥 230001）

目前，造血干细胞移植是治疗血液病最有效的方法之一。但异基因造血干细胞移植后有一定概率伴随免疫触发过程，并会导致严重免疫失调和器官损伤，即急性移植物抗宿主病（acute graft-versushost disease，aGVHD）［1］。移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）最初根据异基因造血干细胞移植后发病时间分为aGVHD和慢性GVHD（chronic graft versus host disease，cGVHD）。移植后100 d内发生排斥反应的称为aGVHD，而＞100 d者称为cGVHD［2］。根据临床症状和病因新评分系统描述，aGVHD的临床表现涉及皮肤、胃肠道和肝脏紊乱，经常表现为皮疹、腹泻、胆红素升高，并与反复感染有关［3］。死亡风险因GVHD分期和分级而异［4］。目前诊断手段主要为基于典型症状的临床诊断或必要时的活组织病理检查，对患者有一定伤害［5］。已有明确临床症状时进行病理检查确诊GVHD治疗效果往往不佳，且无法提前预判。糖皮质激素和其他免疫抑制剂是目前GVHD预防的一线药物，但会产生毒副作用［6］。因此，迫切需要新的治疗方案和靶点改进GVHD治疗效果。

1 外泌体概述

外泌体是一种与质膜融合后释放到细胞外环境的小膜囊泡，具有脂质双分子层膜结构，直径为30～100 nm，几乎可被来自不同生物体的所有细胞产生并分泌，如肝细胞、内皮细胞、成纤维细胞和树突状细胞等，并广泛存在于各种生物体液中，如人体血液、尿液、唾液、乳汁、精液、羊膜液、腹水、关节液及脑脊液等，且可从这些体液中被无创提取出来［7-12］。外泌体含有多种生物大分子，主要为蛋白质和核酸［13］。蛋白质可分为参与其结构形成的结构蛋白及作为外泌体标志的特异蛋白，如CD9、CD63、CD81和HSP70等［14］。核酸包括DNA、mRNA、ncRNA等。外泌体由于其双层膜结构的优势在体液中高度稳定，即使在肿瘤免疫微环境、低氧、氧化应激和致病因素等条件下所受干扰也较小，且通过膜融合、受体-配体作用、胞吞作用等将核酸等信息传入靶细胞，介导细胞间通讯［15］。这些特性使其具有作为治疗策略的潜在应用前景，而外泌体中的miRNA则是最常见的疾病生物标志物之一。

2 外泌体调节免疫应答

2.1 免疫或调节细胞释放的外泌体 既往研究已观察到免疫或调节细胞释放的外泌体可部分调节免疫应答。如ZHANG等［16］研究发现，B细胞产生的CD39+CD73+外泌体能够将肿瘤细胞中的ATP水解为腺苷，进而抑制化疗后的CD8+T细胞反应。另有研究证明，T细胞来源外泌体（T-exo）可在免疫突触形成过程中转移到树突状细胞，并导致树突状细胞基因表达变化，包括免疫应答相关基因［17］。ZHANG等［18］发现，CD4+T细胞释放的外泌体可抑制CD8+T淋巴细胞的细胞毒性反应。而AGARWAL等［19］研究认为Treg来源外泌体（Treg-exo）具有免疫抑制作用，树突状细胞分离的外泌体能够调节免疫应答。

2.2 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）释放的外泌体 MSC是一种具有免疫调节作用的多功能非造血前体细胞，可以很容易地从不同人体组织中分离，具有免疫调节特性，既影响适应性免疫应答，也影响先天免疫应答［20-21］。近期研究提示MSC是一种有潜力的细胞，在GVHD治疗中展现了优越作用，越来越多的证据表明，MSCs的旁分泌效应可能部分由MSC衍生的外泌体介导，加上外泌体的特有优势，MSC-exo吸引了研究者的兴趣。一项来自人BM-MSC-exo的蛋白质组学研究分析显示，MSC-exo中有1 927个蛋白质，而MSCs中有6 342个蛋白质［22］。EIRIA等［23］RNA测序显示，与 MSCs相比，miR-148a、miR-532、let-7f及miR-378在MSC-exo中含量更为丰富。REIS等［24］通过microRNA图谱鉴定出49种miRNA，在外泌体中富集显著高于亲代MSC。表明MSCs发挥的效应可能由MSC-exo介导，并得到了证实和应用，MSC-exo已作为一种替代治疗工具用于各种免疫疾病临床前模型，包括aGVHD。MSC-exo的免疫调节作用也逐渐被阐明。

2.2.1 MSC-exo调控非特异性免疫 MSC-exo的免疫调节作用是通过抑制淋巴细胞增殖并诱导淋巴细胞向抗炎型分化发挥的。调控非特异性免疫方面，MSC-exo可作用于巨噬细胞，LI等［25］研究表明，MSC-exo可抑制巨噬细胞向M1型转化，并提高抗炎因子IL-10水平，下调促炎因子IL-1β和TNF-α水平。ZHAO等［26］发现，MSC-exo通过激活STAT3转录促使巨噬细胞向M2型极化，进而抑制巨噬细胞炎症反应。NK细胞是体内发挥重要作用的免疫细胞，研究表明，人胎肝MSC-exo可抑制NK细胞增殖、活化及细胞毒性［27］。树突状细胞与MSCs研究发现，在未成熟树突状细胞向成熟型转化的培养基中加入骨髓MSC-exo，诱导得到的树突状细胞CD80、CD86、CD83分子表达减少，炎症因子TNF-α、IL-12分泌减少，而抗炎因子IL-10、TGF-β分泌增加，上调抗炎因子水平可促进Treg增殖和免疫抑制作用［28］。

2.2.2 MSC-exo调控特异性免疫 MSC-exo在调控特异性免疫方面也有重要作用。CHEN等［29］将骨髓MSC-exo和外周血单核细胞共培养，结果显示其能促进辅助性T细胞Th1向Th2转换，显著减少促炎因子IL-1β和TNF-α，提高抗炎因子TGF-β水平。BUDONI等［30］研究表明，MSC的微泡可抑制B细胞增殖和抗体分泌，且具有剂量依赖性。

2.2.3 MSC-exo发挥作用实例 鉴于MSC-exo的免疫调节作用，调节性细胞衍生外泌体已被建议作为无细胞治疗工具抑制GVHD期间免疫系统过度激活［31］。已有研究逐步证明了MSC-exo对GVHD的治疗效果。HCT临床环境下，BM-MSC-exo已安全地用于治疗1例类固醇难治性皮肤和肠道Ⅳ级GVHD患者［32］。外泌体输注可显著改善GVHD症状，其携带抗炎分子，不携带促炎细胞因子和凋亡诱导分子，证实了MSC-exo作为抗炎和免疫调节递质的有益作用，为GVHD的治疗方案提供了新的方向。

3 miRNA作为生物标志物

miRNA是一类非编码小RNA，属于短链RNA，广泛存在于真核生物体内，存在于人体的血液、尿液等体液中，参与体内各种生物学过程，在基因表达中调节转录后水平［33］。通过诱导信使RNA降解或转录抑制负向调控基因表达。近年日益增多的研究报道了miRNA在各种疾病中的作用，2007年，VALADI等［34］最早从外泌体中发现了miRNA，并证实miRNA可通过外泌体在细胞间转移，且外泌体的脂质双层囊泡结构可作为生物活性分子载体，miRNA被包裹在外泌体中，避免了被RNaseA催化降解，因此exo-miRNA作为疾病生物标志物具有极大优势［15］。已有研究证明血浆中的多种miRNA在GVHD中发挥作用。

3.1 血液循环miRNA在GVHD中的作用 2012年RANGANATHAN 等［35］首次报道 miR-155在 GVHD调节中发挥作用，且miR-155在aGVHD小鼠T细胞中表达上调。该团队5年后又报道了血清miR-29a表达也在aGVHD诊断前2周升高，为aGVHD防治提供了新的靶点［36］。XIAO等［37］通过分析aGVHD患者血浆miRNA发现，aGVHD患者血浆中miR-423、miR-199a-3p、miR-93*、miR-377、miR-155和 miR-30a等6个miRNAs表达显著高于非GVHD患者，并建立了包括4个miRNA（miR-423、miR-199a-3p、miR-93*和miR-377）、AUC=0.8的GVHD预测模型。CROSSLAND等［38］再次证实了这个结果，且外泌体中miRNA研究发现，与循环中的外泌体相比，非aGVHD患者外泌体中部分miR-423、miR-199和miR-93*表达较高，证实了循环miR-423、miR-199和miR-93*作为aGVHD诊断和预后生物标志物的能力，表明其差异表达在aGVHD病因学中具有潜在作用。ZHANG等［39］利用TaqMan微RNA阵列分析血清中的miRNA得出miR-411在aGVHD发生和恢复时显著下调的结论，开发并验证了包括2个miRNA（miR-26b和miR-374a）的aGVHD预测和诊断模型，可提前1～2周预测 aGVHD增加风险。XIE等［40］通过RT-PCR检测血清miRNAs，也证明了GVHD患者miR-155表达显著上调，与既往研究结果一致，可能成为aGVHD患者的潜在靶向治疗策略。2年后该团队以同种方法检测到aGVHD患者血液中miR-181a-3p表达显著提高，具有敏感性和特异性，可能成为aGVHD患者识别、诊断和预后的潜在生物标志物［41］。WANG等［42］报道了 miR-586作为aGVHD 新型生物标志物的可能性，实时定量PCR检测了52例患者aGVHD前、aGVHD开始时和aGVHD后3个时间点的血浆标本，发现当发生Ⅰ～Ⅱ级aGVHD时血浆miR-586水平降低，感染时血浆miR-586水平升高，且aGVHD组miR-586表达明显高于非aGVHD组。GIMONDI等［43］鉴别出 miR-194 和 miR-518f可能成为早期诊断aGVHD的标志物，与非aGVHD患者相比，aGVHD患者miR-194和miR-518f表达显著上调。ATAROD等［44］发现，aGVHD患者血清miR-503-5p、miR-34a-5p和miR-34a-3p表达均显著高于非aGVHD患者，且miR-34a-3p和miR-503-5p间统计交互作用可诊断aGVHD。ZHAO等［45］基于microRNA聚合酶链反应的芯片技术筛选出miR-153-3p作为aGVHD的潜在生物标志物，且移植后7 d血浆miR-153-3p水平升高，可用于预测aGVHD发生。miRNA作为生物标志物在多项疾病中的作用已被证实，在GVHD中也不例外，目前血液循环miRNA在GVHD中作为生物标志物的可能性已有多项研究，也发现了多个潜在生物靶点，为GVHD诊断及治疗带来了曙光。

3.2 外泌体miRNA在GVHD中的作用 目前报道中，外泌体miRNA作为GVHD的生物标志物较少，中国知网和web of science检索了相关中文和英文文献后，最终纳入2篇文献结果进行综述。刘娇等［46］筛选出 3 个 miRNA（miR-3976、miR-122-5p、miR-3125）在aGVHD中显著上调，而miR-941、miR-4687-5p和miR-4769-5p显著下调。YOSHIZAWA等［47］采用TaqMan低密度芯片进行exo-miRNA表达谱分析，最终证实miR-128在LA GVHD发病时明显上调，miR-128高表达可作为LA GVHD早期诊断新的、无创生物标志物。提示外泌体miRNA作为无创生物标志物的潜力，值得继续探索。

4 总结与展望

目前诊断方法延误了GVHD的治疗时机，是导致其治疗效果不佳的原因之一，发展一种简单易行的早期诊断方法对及时治疗具有重要意义。miRNA这种具有多种优势的标志物已被初步证明有效，在其他肿瘤中已被作为诊断标志物，能否成为GVHD的早期诊断标志物值得深入探索。包裹在外泌体中的miRNA的稳定性提示其具有更为广阔的应用前景。在外泌体中筛选miRNA标志物可能为早期筛选GVHD、降低GVHD发病率提供有效方案。