高效液相色谱法测定尼群地平中3 种杂质

卞广利，徐艳梅，郝丽娟，苗会娟，王春霞，高燕霞

（1.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200 ； 2.河北医科大学第二医院药学部，石家庄 050000）

尼群地平为二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂［1-3］，由拜耳公司研发，于1985 年4 月在德国上市［4］，可用于高血压、充血性心力衰竭以及冠心病等疾病的治疗［5-7］。尼群地平具有起效迅速、药效稳定以及副作用小等优点［8-9］，其制剂尼群地平片已被广泛应用于临床治疗。药品中杂质的含量对于临床治疗的疗效及副作用影响较大，且原料药物的质量是影响制剂品质的主要因素［10］，因此需对原料药物中的杂质进行质量控制，减少药物引起的副作用，保证药物的疗效。

关于尼群地平有关物质的控制，我国药典目前仅对其中杂质A 的测定方法进行了规定［11］，尚无杂质B 及杂质C 的测定方法，亟需完善其有关物质测定的方法。笔者采用尼群地平原料药为研究对象，通过参照国内外药典及相关资料［12-15］，对色谱条件进行优化，建立了简便、快捷的高效液相色谱法用于尼群地平原料药中杂质A、B、C 的含量测定，为尼群地平原料药的质量控制提供了参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20AD 型，配备二极管阵列检测器（DAD），日本岛津公司。

电子天平：XS105 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

尼群地平对照品：含量（质量分数）为100%，批号为100585-201705，中国食品药品检验研究院。

尼群地平杂质对照品：杂质A、B、C 的含量（质量分数）分别为98.0%、99.0%、98.4%，批号分别为35696、92.01.08.02、140607，英国LGC 公司。

四氢呋喃、乙腈：均为色谱纯，德国默克公司。实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBOX Eclipse XDB C18柱[250 mm×4.6 mm，5 µm，安捷伦科技（中国）有限公司]，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器：二极管阵列检测器；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-四氢呋喃-水（体积比为20∶24∶56）；洗脱方式：等度洗脱；流量：1 mL/min；检测波长：235 nm；进样体积：10 μL。

1.3 溶液的配制

供试品溶液：精密称取尼群地平原料药约20 mg 于10 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 四氢呋喃溶解，用色谱流动相定容至标线，摇匀，即得。

标准储备液：精密称定尼群地平、杂质A、杂质B 及杂质C 对照品适量分别置于10 mL 容量瓶中，分别加入2.5 mL 四氢呋喃溶解，用流动相稀释定容至标线，配制成尼群地平、杂质A、杂质B、杂质C的质量浓度分别为1.021、1.016、1.024、0.989 mg/mL的标准储备液，于-20 ℃避光保存。

杂质定位溶液：精密量取杂质A、B、C 标准储备液各1 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，依次用色谱流动相定容至标线，摇匀，配制成杂质A、B、C 质量浓度分别为40.64、40.96、39.56 μg/mL 的杂质定位溶液。

混合标准溶液：依次精密量取尼群地平、杂质A、杂质B 及杂质C 标准储备液各1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用流动相稀释定容至标线，配制成尼群地平、杂质A、杂质B 及杂质C 的质量浓度分别为10.21、10.16、10.24、9.89 μg/mL 的混合标准溶液，于-20 ℃避光保存。

系列混合标准工作溶液：分别精密量取0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、10 mL 混合标准溶液，置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容至标线，配制成系列混合标准工作溶液，于-20 ℃避光保存。系列混合标准工作溶液的质量浓度见表1。

表1 系列混合标准工作溶液质量浓度 μg/mL

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别对尼群地平及杂质A、B、C 的标准储备液进行扫描发现，尼群地平及杂质A、B、C 的最大吸收均在235 nm 附近，故选择235 nm 进行检测。

2.2 杂质定位及分离度

取1.3 中混合标准溶液、杂质定位溶液及供试品溶液，按1.2 色谱条件进行测定，对各杂质进行定位。杂质定位溶液、混合标准溶液、及供试品溶液色谱图分别见图1、图2 和图3。

图1 3 种杂质定位溶液色谱图

图2 混合标准工作溶液色谱图

图3 供试品溶液色谱图

样品中尼群地平与各杂质色谱峰互不干扰，分离度结果列于表2。由表2 可知，主峰与相邻杂质、各杂质间的分离度均大于1.5，各成分分离度良好，专属性良好，表明该法可准确测定杂质含量。

表2 尼群地平与已知杂质的定位及分离试验结果

2.3 破坏试验

精密称取尼群地平原料约20 mg，分别置于5只10 mL 容量瓶中，依次进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏，按照1.2 色谱条件进行测定，考察各杂质含量变化及分离情况。试验结果表明，尼群地平原料药在强酸、强碱及高温条件下稳定，在强氧化条件较稳定，在光照条件下不稳定，需避光操作。

2.4 线性关系、检出限及定量限

在1.2 色谱条件下对系列混合标准工作溶液进行测定，以尼群地平及各杂质的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。取各标准储备液进行逐级稀释，信噪比为3 时对应的质量浓度作为检出限；信噪比为10 时对应的质量浓度作为定量限。3 种杂质的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限结果见表3。由表3 可知，3 种杂质在各自的质量浓度范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，检出限为0.152～0.171 ng，定量限为0.494～0.512 ng。

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 精密度试验

取同一批尼群地平原料，按1.3 方法平行制备6 份供试品，按照1.2 色谱条件进行分析，测定结果见表4。由表4可知，6 份样品中杂质B 及杂质C均有检出，各杂质测定结果的相对标准偏差均小于2%，表明该方法具有良好的精密度。

表4 精密度试验结果

2.6 加标回收试验

精密称取9 份约20 mg 尼群地平原料药于10 mL 容量瓶中，分别加入2.5 mL 四氢呋喃溶解，再分别加入混合标准工作液0.8、1.0、1.2 mL 各3 份，加入流动相定容至标线，摇匀。按1.2 色谱条件进样测定，试验结果见表5。

表5 加标回收试验结果

由表5 可知，杂质A、B、C 的平均回收率分别为92.38%、92.74%、93.07%，表明该方法具有较高的准确度，可有效测定尼群地平中的杂质含量。

2.7 稳定性试验

精密量取1 mL 混合标准溶液，置于10 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 四氢呋喃溶解，使用流动相稀释至标线，摇匀，于室温下避光储存，在1.2 色谱条件下，分别于0、1、2、3、4 h 后进行测定，考察各杂质峰面积的变化，并计算不同时间峰面积相对标准偏差，结果见表6。

表6 稳定性试验结果

由表6 可知，溶液在放置4 h 后，3 种杂质的含量无明显变化，测定结果的相对标准偏差均小于3.0%，表明混合标准溶液在室温下避光储存稳定性良好。

2.8 耐受性试验

选取混合标准溶液，将流量由1.0 mL/min 分别调整为0.8、1.2 mL/min，将柱温在40 ℃的基础上分别调整为35、45 ℃，选择AgelaVenusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）及Thermo BDS HYPERSIL C1（250 mm×4.6 mm，5 µm）两种色谱柱进行耐受性试验，对各杂质之间的分离情况及含量进行考察。结果表明，色谱参数的微调不影响尼群地平中有关物质的含量测定，出峰顺序未发生改变。主峰与各杂质峰分离良好，各杂质含量无明显变化。建立的方法耐受性良好，可有效用于尼群地平中杂质A、B、C 的含量测定。

2.9 样品测定

取尼群地平原料药20 mg（批号为20000972-B33201204），按照1.3 方法制备供试品溶液，按1.2色谱条件进行测定，采用回归法计算各杂质含量，计算结果显示，杂质A 未检出，杂质B 含量为0.47%，杂质C 含量为0.19%。

3 结语

建立了高效液相色谱法对尼群地平中杂质A、B、C 进行含量测定，该方法具有较好的重复性，操作简单且迅速。该方法对尼群地平中有关物质的控制进行了补充，不仅可为尼群地平质量控制提供参考，更可通过对原料药的控制保证药物临床应用的安全、有效，具有较高的实际应用价值。