尿路分离利奈唑胺不敏感粪肠球菌耐药机制及毒力基因研究

牛冬梅，宋佳希，周万青，刘兴全

0 引 言

近年来，作为肠道正常菌群的肠球菌属已成为院内感染重要病原菌，可造成患者尿路感染、血流感染等[1]。其中粪肠球菌和屎肠球菌所造成的感染比例占肠球菌属90%[2]。流调数据显示，肠球菌在尿路中的分离率占第一位[3]。由肠球菌造成的感染难治性与菌株天然耐药或获得性耐药，特别是万古霉素耐药、利奈唑胺耐药肠球菌的不断检出[3-4]，给临床抗感染诊疗带来挑战。利奈唑胺(linezolid，LZD)作为噁唑烷酮类抗生素，2001年上市并用于万古霉素耐药肠球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE)等多种革兰阳性菌的感染治疗。然而，近年来，利奈唑胺耐药粪肠球菌的临床检出呈逐年上升趋势[4]。研究发现，肠球菌所携带的多种毒力基因(esp、gelE、asa1、cylA等)决定了菌株的致病性，同时对于生物膜形成也至关重要[5]。更为严重的是，携带多种毒力基因且对多种抗菌药物耐药菌株的出现[6]，增加临床治疗的难度。为了探明临床尿路感染中分离利奈唑胺不敏感粪肠球菌具体耐药机制及毒力基因的携带情况，本研究对临床尿路感染分离粪肠球菌携带毒力基因情况及与利奈唑胺耐药间的关系进行探讨，为临床治疗提供数据依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源收集南京鼓楼医院2014-2019年临床中段尿样本中分离培养获得非重复粪肠球菌株72株，使用Vitek 2 Compact 全自动微生物分析仪鉴定到菌种。依据菌株对利奈唑胺最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)分为利奈唑胺不敏感菌株(MIC≥4 μg/mL)和敏感菌株(MIC≤2 μg/mL)，分别为23株和49株。粪肠球菌ATCC 29212质控菌株、cfr基因阳性对照头状葡萄球菌SA10106及optrA阳性菌株为南京鼓楼医院微生物室保存菌株[4]。

1.2 主要仪器和试剂Vitek 2 Compact全自动鉴定药敏分析系统及配套GP鉴定卡、GP67药敏卡(法国梅里埃公司)；利奈唑胺E-test(安图公司)；2×Taq Mix(DBI公司)；PCR扩增仪(ABI公司)；蛋白酶K(Merck公司)；琼脂糖干粉(法国Biowest公司)；100 bp DNA Marker(大连Takara公司)；Gelrad染色液(美国BIOTIUM公司)；电泳仪及GelDoc XR型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rod公司)；PCR引物合成及扩增产物测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 药敏试验采用Vitek 2 Compact全自动鉴定药敏分析系统及配套GP67药敏卡进行药物敏感性检测；对检出利奈唑胺不敏感菌株采用E-test进行复核，结果判读依据CLSI 2019标准[7]进行。

1.4 耐药基因扩增及测序采用加热煮沸法提取细菌DNA[8]，挑取纯培养菌落于内含200 ng/mL蛋白酶K溶液的1.5 mL离心管内，56 ℃水浴2 h，后置95 ℃水浴10 min，13 000×g离心30 s，上清液即为基因检测模板。参照文献[8]合成介导利奈唑胺耐药决定基因cfr、optrA和23S rRNA V区扩增引物并进行PCR扩增分析。引物序列见表1。采用25 μL体系：2×Taq Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 °C 5 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，共30个循环；72 °C 7 min。阳性扩增产物由上海生工生物公司进行Sanger测序分析，并经BLAST比对分析。

1.5 毒力基因PCR扩增参照文献[9-10]合成肠球菌毒力基因cylA、esp、asal、hyl、gelE和agg扩增引物并进行PCR扩增检测。引物序列见表1。其中cylA、esp、asa1、hyl和gelE基因为50 μL多重检测体系：2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，cylA、esp、asa1、hyl和gelE的上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 13 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。agg为25 μL反应体系：2×Taq Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，Gelrad染色后观察结果。

表1 耐药基因扩增及测序所用引物序列

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0进行数据分析，率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 药敏结果23株利奈唑胺不敏感粪肠球菌对利奈唑胺的MIC分布为4～256 μg/mL，其中MIC 4 μg/mL为2株，MIC 6 μg/mL为2株，MIC 8 μg/mL为1株，MIC 12 μg/mL为5株，MIC 16 μg/mL为3株，MIC 24 μg/mL为3株，MIC 32 μg/mL为4株，MIC 48 μg/mL为1株，MIC 256 μg/mL为2株。所有菌株对万古霉素均敏感。

2.2 耐药基因结果23株利奈唑胺不敏感粪肠球菌中13株检出optrA基因，其余10株未检出该基因；所有菌株未检出cfr基因及检出23S rRNA V区突变。

2.3 毒力基因结果72株粪肠球菌检出asa1(81.9%，59/72)、esp(75%，54/72)、cylA(72.2%，52/72)、gelE(62.5%，45/72)和agg(19.4%，14/72)基因，未检出hyl基因。23株LZD不敏感菌株以asa1(73.9%，17/23)基因检出率最高，其次为esp、cylA、gelE和agg；49株LZD敏感菌株中asa1(85.7%，42/49)基因检出率最高，其次为cylA、esp、gelE和agg。LZD敏感菌株中cylA和gelE基因检出率高于LZD不敏感菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 尿路分离粪肠球菌毒力基因携带情况[阳性株数(%)]

3 讨 论

革兰阳性球菌耐利奈唑胺主要由23S rRNA等位基因V区核苷酸突变，核糖体L3和(或)L4的突变，以及菌株携带氯霉素-氟甲砜霉素耐药基因(chloramphenicol-florfenicol resistance，cfr)[8, 11-12]，从而导致利奈唑胺药物无法结合作用靶位而造成菌株耐药。而在肠球菌中的耐药决定基因研究中发现，optrA决定基因[4]以及由新型poxtA基因[13]介导的耐药检出越来越多，从而揭示革兰阳性菌对利奈唑胺耐药机制的多元化。本课题组前期研究发现，获得cfr基因或 23S rRNA G2576T突变是导致凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺耐药的主要机制[11]，并存在江苏地区内的克隆传播[8]。而在肠球菌属尤其是粪肠球菌耐药监测中发现，利奈唑胺耐药率呈逐年上升趋势，optrA是主要决定基因[4]。本次调查尿路分离利奈唑胺不敏感粪肠球菌中发现，23株不敏感菌株中19株MIC大于等于8 μg/mL，其中13株检出optrA基因。由此可见，造成尿路感染利奈唑胺耐药粪肠球菌主要由optrA基因介导耐药。当然，可能存在其他未知机制共同介导。

肠球菌感染及其致病性与其携带毒力因子有关。目前认为肠球菌黏附和致宿主细胞损伤相关的毒力基因主要有：esp基因编码肠球菌表面蛋白，对于细菌黏附、定植、侵袭免疫系统及生物膜形成均发挥重要作用[14]；asa1基因编码一种肠球菌表面结合蛋白，介导细菌的聚集和质粒的传递，增加在宿主细胞的附着能力；hyl基因编码透明质酸酶，协助细菌在组织内扩散；gelE基因编码明胶酶，溶解宿主细胞的胶原蛋白或组织蛋白，使宿主细胞丧失完整性，有利于肠球菌及其致病物质向组织周围扩散[15]；cylA基因编码细胞溶血素，可溶解细胞，发挥毒性作用并加重肠球菌感染的严重程度[16]，同时与尿路感染粪肠球菌的生物膜形成有关[17]；agg基因编码胶原黏附蛋白等。本研究对造成尿路感染粪肠球菌携带毒力基因调查分析发现，主要携带asa1(81.9%，59/72)、esp(75%，54/72)、cylA(72.2%，52/72)、gelE(62.5%，45/72)和agg(19.4%，14/72)基因。所携带毒力基因的功能发挥可能与尿路感染过程中细菌生物膜形成及侵袭性感染有关[14-18]。而对LZD不敏感和敏感菌株的毒力基因分析发现，LZD敏感菌株中cylA和gelE基因检出率高于LZD不敏感菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。提示，敏感菌株较不敏感菌株所携带的毒力基因更多，其致病性更强；而菌株在获得利奈唑胺耐药的同时，可能丢失部分的毒力基因和致病性减弱。具体的机制有待增补菌株数量及深入研究。

综上，造成尿路感染粪肠球菌对利奈唑胺不敏感主要由optrA基因介导；尿路分离利奈唑胺不敏感粪肠球菌在cylA和gelE基因携带率上低于敏感菌株，具体机制仍需进一步研究。本研究数据对于更好地研究利奈唑胺耐药粪肠球菌在尿路中致病机制奠定理论依据。