肿瘤精准治疗新策略——靶向调控DNA损伤修复功能的长链非编码RNA

苏小茉， 张美英， 高嫒嫒， 郭明洲

中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科医学部，北京 100853

随着对长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在生长发育和各种生命活动中功能的认识，其在疾病发生发展及诊治中的应用价值也被高度关注。lncRNA在肿瘤中的表达异常已被广泛报道，但获得lncRNA全长序列，并明确其在肿瘤中的作用和机制的lncRNA数量非常有限。与蛋白编码基因不同，lncRNA的数量非常庞大，目前仍无法准确获得基因组编码lncRNA的总数。由于lncRNA在基因组上的分布比较广泛，绝大多数的lncRNA与蛋白编码基因部分或完全重叠，导致其功能研究受到蛋白质编码基因的影响，如常用的基因敲降或敲除技术均可能同时影响非编码RNA和蛋白编码基因的功能。因此，目前绝大多数报道的具有系统功能研究的lncRNA均为基因间lncRNA。随着各种前沿生物技术的发展，绝大多数尚未被解析的lncRNA，将不断被明确其在肿瘤等复杂性疾病中的作用及机制，为疾病的诊断和防治提供新的策略。

1 lncRNA概述

非编码RNA是近年来被人们认识的一类新的转录子，虽然由基因组编码但不翻译为蛋白质。非编码RNA在各种细胞功能和生命活动中发挥着重要作用。目前认为，>75%的人类基因组均具有转录功能，并编码大量的非编码RNA[1-3]。lncRNA是一类长度>200 nt的非编码RNA，在染色质结构重塑、基因表达调控、细胞生长和分化、发育，以及各种信号通路的调控中均发挥重要作用。由于lncRNA功能的多样性和复杂性，随着其数量的不断增加，如何将发现的大量lncRNA转录子分类已成为一个挑战性的问题。根据在基因组上的位置，将其分为基因内(位于内含子)、基因间(两个蛋白编码基因之间)、增强子(位于启动子区和增强子区)、双向(位于编码基因附近的对应链，opposite strand)、有义链重叠(与各种编码基因的一个或多个外显子和内含子在有义链重叠)和反义(在DNA的反义链)lncRNA。根据其功能将lncRNA分为信号通路(与特定的信号通路相关)、诱饵(捕获转录因子或抑制因子)、引导(与具有调控作用或酶活性的蛋白复合物结合引导到特定的靶基因启动子区或基因组的某一特定位点调控下游基因或信号通路的功能或基因表达)、支架(作为与各种蛋白复合物结合的关键平台，并引导至特定的基因组位点或靶基因启动子区调控基因的表达及染色质的构象)[4-5]。人的lncRNA数量预计为2×104～1×105个或更多[6]。然而，目前发现的绝大多数lncRNA的功能和作用机制仍不清楚，并且还有大量的lncRNA有待发现。很多lncRNA在各种肿瘤中异常表达，且一些lncRNA的异常表达具有肿瘤特异性。由于某些lncRNA具有组织/细胞特异性，因此有望获得新的肿瘤特异性诊断标志物和个体化治疗靶标。

lncRNA的异常表达与肿瘤的发生和转移密切相关，有一些lncRNA扮演癌基因角色，而另一些扮演抑癌基因角色。因此，发现新的与肿瘤相关的lncRNA并明确其功能和作用机制，有望在肿瘤诊断和治疗方面获得新的突破，然而目前仍面临许多挑战性的问题。虽然，应用高通量测序等技术进行转录组分析，能够在不同肿瘤中分离出大量异常表达的lncRNA转录本或片段，然而弄清这些lncRNA的功能和机制是一项极具挑战性的工作[5]。在肿瘤中发现的大量上调或下调的lncRNA或其片段，如何获得具有重要功能的lncRNA也是一个挑战性的问题。目前，由于绝大多数lncRNA的结构和生物功能尚未注释，因此该领域仍处于起步阶段。在未弄清lncRNA的结构和功能之前而发展的基于lncRNA的治疗方法，就像是在黑暗中打枪一样缺乏明确的目标。另外，与蛋白编码基因不同，lncRNA在种属间非常不保守，在体外和动物模型中获得的lncRNA的结构和功能的信息，以及治疗策略，并不一定适合在人类疾病中的应用，仍然需要结合人类疾病的临床标本检测及进一步的试验。因此，需要直接从人类疾病样本中分离和鉴定出新的lncRNA，并对其功能和作用机制进行深入研究[5, 7]。

2 lncRNA对肿瘤相关信号通路的调控作用

肿瘤相关lncRNA已成为肿瘤生物学最主要的热点。大量的证据表明，异常表达的lncRNA通过不同的信号通路促进细胞的持续增殖和代谢异常，最终导致肿瘤的产生、进展和转移[8]。

lncRNA BC032913通过上调TIMP3的表达和抑制β-catenin的核转位而抑制Wnt信号通路，抑制结肠癌的转移[9]。lncRNA CCAL通过激活Wnt信号通路而促进细胞的增殖、侵袭、迁移和细胞周期的进展，导致结肠癌的发生和发展[8，10]。lncRNA MALAT1通过增加PI3K和AKT磷酸化激活PI3K/AKT信号通路，导致胃癌细胞对顺铂的耐药[11]。LINC01503通过激活ERK/MAPK和PI3K/AKT信号通路而促进食管癌细胞的侵袭和迁移。AK001796通过激活P53信号通路而影响食管癌的生长[12]。在结肠癌和肝癌中，lncRNA MT1JP通过与TIAR相互作用而激活P53信号通路[13]。lncRNA CDKN2B-AS通过调控hTERT的表达而影响食管癌的生长。MALAT1、SNHG16等lncRNA通过影响EMT而促进食管癌的转移[12，14-17]。lncRNA NORAD通过激活TGF-β信号通路而促进肺癌的转移[18]。lncRNA gadd7可通过与TDP-43相结合诱导Cdk6 mRNA的降解而影响DNA损伤修复(DNA damage repair，DDR)[19-22]。lncRNA-p21通过调控Hippo信号通路而抑制胃癌的转移[23]。lncRNA VESTAR在食管癌中通过直接与VEGFC mRNA的相互作用而促进其稳定性，有望成为食管癌淋巴结转移患者的治疗靶标[24]。

3 DDR机制及肿瘤的“协同致死”治疗策略

在自然情况下，每天每个细胞可以通过各种内外因素发生2×105个DNA损伤。外部因素包括紫外线、辐射和基因毒性药物[25-26]，以太阳光来源的紫外线照射为例，每天每个细胞可以诱导1×105个DNA损伤[26-27]。内源性因素多数来自于代谢的副产物，如活性氧。细胞轻度DNA损伤可以经过修复而恢复正常；不能完全修复将导致基因的突变或缺失，累积性的癌基因激活突变(驱动基因突变)或抑癌基因缺失将导致肿瘤的发生。严重的DNA损伤如不能修复将会通过染色体灾难等死亡机制导致损伤细胞的死亡。

为了应对DNA损伤，生物进化出几个具有部分重叠或互补功能的DDR通路。在哺乳类动物细胞内有7个主要的DDR通路，包括直接修复(direct repair)、错配修复(mismatch repair，MMR)、碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)、同源重组修复(homologous recombination repair，HR)、经典非同源末端连接修复(classical non-homologous end joining，cNHEJ)和选择性末端连接修复(alternative end joining，Alt EJ)[28-30]。肿瘤的关键治疗方法之一，就是利用放疗或化疗药物诱导肿瘤细胞的DNA损伤，而肿瘤细胞DDR的缺陷增加其对放化疗的敏感性[29，31]。

“协同致死”的概念源于对果蝇遗传模型的研究，用于描述两个或更多基因同时发生突变而导致细胞的死亡[32]。在肿瘤治疗中“协同致死”的基本原理是，肿瘤细胞中的一个DDR通路存在缺陷，通过其另外的补偿通路而存活，阻断该补偿通路将导致肿瘤细胞死亡。最经典的例子是在BRCA1/2突变而表达缺失的细胞，应用PARP抑制剂导致细胞的死亡[29，33-35]。在肿瘤中，应用PARP抑制剂治疗BRCA1/2突变的细胞是一个完美的“协同致死”治疗模型，目前几乎所有的“协同致死”研究均局限于BRCA1/2的突变。然而，BRCA1/2突变在多数肿瘤中均非常少见。随着对DDR机制的深入理解，新的针对DDR关键分子的靶向治疗成为抗肿瘤治疗的新策略。约有450个基因编码参与DDR的蛋白均可能成为潜在的治疗靶标。大量的DDR关键分子的抑制剂仍在进行临床试验，如：CBP-501和Prexasertib(CHK1/2抑制剂)、AZD-1775(WEE1抑制剂)、AZD-6738和VX-970(ATR抑制剂)、LY-3023414(DNA-PK抑制剂)和AZD-0156(ATM抑制剂)[31，36]。

通过对该模型生物学功能的学习和深度分析，发现在肿瘤中具有与BRCA1/2突变相似的功能异常改变时，应用与BRCA1/2突变肿瘤同样的治疗方案可以获得同样的效果，称之为“BRCAness”[37]。“BRCAness”可以是其他DDR相关基因的异常，如ATM、ATR、PALB2、MGMT等，或与细胞命运相关/或参与细胞周期的信号通路的功能异常改变，如：Notch、PI3K/AKT、ERK等信号通路的功能异常；根据Knudson“二次打击”学说，“BRCAness”既可以是基因突变，也可以是表观遗传异常，如DNA甲基化或lncRNA表达异常等[38-40]。因此，明确不同信号通路之间的补偿机制和调控网络将极大地促进“协同致死”策略的发展和应用。基于“BRCAness”、Knudson“二次打击”学说和“协同致死”原理，我们在食管癌中发现NRN1甲基化沉默时，PI3K和ATR抑制剂具有“协同致死”效应[38]。同时，在肺癌中发现TMEM176A甲基化沉默和ATM抑制剂(AZD0156)具有“协同致死”效应[39]。这是我们首次根据Knudson“二次打击”学说、“协同致死”原理和“BRCAness”原理，成功建立的基于表观遗传异常的“协同致死”策略的例证。

基于表观遗传异常所导致的基因/信号通路功能缺失(loss of function)，特别是DDR基因、细胞周期调控基因和细胞命运相关基因的表观遗传沉默，为肿瘤的“协同致死”提供了新的治疗策略[29，31，36，41-42]。在此基础上有望解决在肿瘤中应用经典靶向治疗无法解决的问题，如突变导致的抑癌基因功能缺失或表观遗传异常导致的基因表达缺失的“undruggable”靶标。值得注意的是，“协同致死”原理可以用于探索在肿瘤中无法靶向的异常改变，通过靶向其具有补偿功能的伙伴而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的[43]，如抑癌基因突变或表观遗传异常导致的基因表达缺失。

4 lncRNA、DDR、细胞命运及其在“协同致死”策略中的应用前景

目前，对于lncRNA的认识仍处于初始阶段，大量新的在肿瘤异常表达的lncRNA或片段不断被发现，但明确其功能仍然是一个具有挑战性的问题。近年的研究发现，lncRNA具有明显的组织/细胞特异性或肿瘤特异性的特点，并发现部分lncRNA通过调控肿瘤相关信号通路而影响肿瘤的发生和发展。某些lncRNA可直接或间接地调控细胞命运或DDR相关基因而影响肿瘤细胞对放化疗的敏感性。Sharma等[44]通过比较新制癌菌素(neocarzinostatin)、喜树碱(camptothecin)和依托泊甙(etoposide)诱导前后hTert永生化人纤维母细胞lncRNA的表达，鉴定出在这三种化疗药物诱导下均高表达的lncRNA DDSR1(DNA damage-sensitive RNA1)。进一步的研究发现，lncRNA DDSR1通过同源重组修复方式(homologous recombination repair, HRR)促进DNA损伤的修复。Shahabi等[45]在肿瘤中鉴定出lncRNA LINC00261通过磷酸化激活ATM而促进DNA损伤修复。lncRNA SPARCLE(suicidal PARP-1 cleavage enhancer)结合PARP-1促进其降解而影响DNA的损伤修复[46]。lncRNA Aerrie(LINC01013)通过与YBX1相互作用促进DNA的同源重组修复[47]。lncRNA也可通过参与Wnt、PI3K、AKT等信号通路而参与DNA的损伤修复。由于深度测序技术和表观基因组前沿技术的发展，新的lncRNA的数量快速增加，且在肿瘤中异常表达lncRNA的数量也在不断增加。目前，最具挑战性的问题是如何明确lncRNA的特征和阐明其功能和在肿瘤中的作用机制。随着更多与DDR或细胞命运相关lncRNA特性的明确，靶向这些关键lncRNA或其补偿通路关键分子的分子靶向治疗或“协同致死”治疗将具有更广泛的应用前景。