正交法优化超声波提取橘皮果胶的工艺研究

李靓，朱涵彬，李长滨，潘春梅，岳晓禹，王梦蝶

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046)

柑橘作为一种水果，因含有多种营养成分、保健功效良好而深受消费者喜爱。但在柑橘直接食用或加工生产中，产生约20%～50%果皮渣废弃物，若用物理或化学方法处理，既可得到丰富的糖类、维生素等高营养价值物质，还可得到果胶[1]、精油[2]、色素[3]、黄酮[4]等生物活性物质。橘皮还可应用于低糖型风味果酱的研制[5]，诱导酚类抗氧化活性应用于功能性酱油开发等[6]，在食品、药品及调味品等行业领域具有广阔的应用前景。果胶作为食品添加剂被大量使用，若能从橘皮中快速提取优质果胶可将资源最大化利用。因此，研究优化果胶的提取工艺、提高其得率显得尤为重要。

果胶提取方法主要有酸水解法、酶法、超声波法及复合法等[7-11]。超声波能破坏细胞结构，增加细胞壁的通透性，促进果胶游离，使得提取速率加快。酸水解法将不溶性原果胶在酸作用下转化为水溶性果胶，使得提取产量加大。因此，本文拟采用超声波辅助酸法提取橘皮果胶，通过正交试验优化单因素提取条件从而提高果胶得率，为橘皮果胶的研究开发提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四川青见柑橘皮：购于郑州市丹尼斯超市；95%乙醇：新乡市三伟消毒制剂有限公司；无水乙醇(AR)：莱阳经济技术开发区精细化工厂；硫酸(AR)：烟台市双双化工有限公司；氢氧化钠(AR)：西安天茂化工有限公司；0.1 mol/L盐酸：广州和为医药科技有限公司；咔唑(AR)、半乳糖醛酸试剂(AR)：上海麦克林生化科技有限公司；缓冲溶剂等。

1.2 仪器与设备

FA2104型电子天平 上海力辰科技有限公司；DHG-9140型电热鼓风干燥机 广州康恒仪器有限公司；UV-759CRT型分光光度计 上海菁华科技有限公司；RHP-500A型粉碎机 浙江永康市荣浩工贸有限公司；SHZ-C恒温水浴振荡器 杭州艾普仪器设备有限公司；3S型超声波反应器 江苏江大五棵松科技有限公司；TDZ4-WS型离心机 河南攀之峰科技有限公司；PHS-25型酸度计 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；HH-6型恒温水浴锅 常州市万丰仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 半乳糖醛酸标准曲线的绘制

根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 2016-2011对果胶进行定量[12]。

在100 mL容量瓶中加入0.1000 g半乳糖醛酸试剂，加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液定容成浓度为1000 mg/L的溶液。吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分别放入25 mL容量瓶中，固定质量浓度为0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg/L的半乳糖醛酸溶液。

取1 mL不同浓度的半乳糖醛酸溶液放入比色管中，加入0.25 mL咔唑-乙醇溶液，再迅速加入5.0 mL浓硫酸后摇匀，80 ℃恒温水浴振荡器振荡20 min。取出比色管待冷却，用分光光度计在525 nm处测定不同浓度溶液的吸光度。以半乳糖醛酸溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，经过3次试验得到拟合度最好的线性方程为y=0.0077x+0.0042，相关系数为R2=0.9989。

1.3.2 操作步骤

将新鲜橘子剥皮后置于沸水中煮5～10 min，使可以分解果胶的酶失活。将煮后的橘皮用60 ℃水反复漂洗后置于80 ℃干燥箱中干燥6 h至恒重，再用粉碎机粉碎成细小粉状于40目筛过筛即得橘皮粉末以备用。

取一定量粉末加蒸馏水后用0.1 mol/L盐酸调节，放置于超声波反应器中控制温度和时间，取上清液过滤，将95%乙醇倒入滤液中搅拌，将离心机设置在4000 r/min，时间为0.25 h离心，将所得果胶在85 ℃下干燥即得果胶沉淀。将果胶沉淀加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液，定容至100 mL容量瓶中。

1.3.3 结果计算

取1 mL果胶稀释液按制作标准曲线的方法操作，测定果胶稀释液的吸光度并记录结果。根据下式计算果胶提取率A，并保留四位有效数字。

式中：ρ为通过线性方程算出的稀释液的半乳糖醛酸质量浓度(mg/L)；V为果胶沉淀溶解并定容的体积(mL)；m为样品的质量(g)。

1.4 单因素试验条件设计

通过设计单因素试验，设置变量研究4个影响因素：料液比设置成5个水平(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，pH设置成5个水平(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5)，超声温度设置成5个水平(55，60，65，70，75 ℃)，超声时间设置成5个水平(20，30，40，50，60 min)，探究各因素对橘皮果胶提取率的影响，平行3次试验取平均值。

1.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，以果胶提取率为结果指标，选择料液比、pH值、超声温度和超声时间为考察因素，选取3个水平，用L9(34)正交表设计试验，通过超声波辅助酸法优化橘皮果胶的提取工艺条件，得出果胶最大提取率，再确定最佳工艺条件，见表1。

表1 L9(34)正交试验因素与水平设计表

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 最佳料液比的确定

准确称取5份1 g橘皮粉末，将料液比设定为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，调整溶液pH值为1.5，在超声温度为70 ℃、超声时间为40 min时取出离心。倒入95%乙醇取得果胶沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。测定几次取平均值，结果见图1。

图1 料液比对果胶提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of pectin

由图1可知，随着料液比增大，吸光度呈先上升后下降的趋势。在料液比为1∶15时，吸光度最大，为0.176，换算式果胶提取率为22.31%。这是由于料液比低于1∶15时，混合液比较黏稠，使得在过滤过程中比较困难，果胶可能滤出不完全，而其他果胶被留在残渣中难以滤出，从而导致提取率较低。当料液低高于1∶15时，用乙醇沉淀时会导致滤出的果胶浓度较低，使其转化成果胶的量也会减少。

2.1.2 最佳pH的确定

准确称取5份1 g橘皮粉末，加盐酸调整溶液pH值分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，在料液比为1∶15、超声温度为70 ℃、超声时间为40 min时取出离心。倒入95%乙醇取得果胶沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。测定几次取平均值，结果见图2。

图2 pH值对果胶提取率的影响Fig.2 Effect of pH value on the extraction yield of pectin

由图2可知，随着溶液pH值的变化，吸光度呈先上升后下降的趋势。当溶液pH值在1.5时的吸光度比其他水平值高，得到果胶提取率最大，为22.28%。强酸(如盐酸、硫酸等)使用有利于橘皮中原果胶溶解，但是酸度过低时会导致果胶内部被破坏，从而降低果胶的提取率。

2.1.3 最佳超声温度的确定

准确称取5份1 g橘皮粉末，选择料液比为1∶15、pH值为1.5时，按超声温度为55，60，65，70，75 ℃，超声时间为40 min取出离心。倒入95%乙醇取得果胶沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。测定几次取平均值，结果见图3。

由图3可知，随着超声温度升高，吸光度呈现先上升后下降的趋势。当超声温度为70 ℃时，吸光度值最大，果胶提取率为22.53%。温度的升高可加快果胶提取速率，若大于70 ℃，温度过高，可能会导致果胶分解，反而会使橘皮果胶的提取率下降。

2.1.4 最佳超声时间的确定

准确称取5份1 g橘皮粉末，选择料液比为1∶15、pH为1.5、超声温度为70 ℃时，设置超声时间分别为20，30，40，50，60 min取出离心。倒入95%乙醇取得果胶沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。测定几次取平均值，结果见图4。

图4 超声时间对果胶提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of pectin

由图4可知，随着超声时间增加，吸光度呈先上升后下降的趋势。在超声时间为40 min时，吸光度值最大，果胶提取率为22.38%。当超声时间在20～40 min，由于超声时间过短，使果胶不能充分地溶解到溶剂中；当超声时间大于40 min时，果胶分子结构在长时间作用下发生分解变性使果胶提取率降低。因此，要控制好超声时间，防止果胶发生降解。

2.2 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，进行L9(34)正交试验，试验结果见表2。

表2 L9(34)正交试验方案及结果分析表

由表2中极差R值大小可知，B(pH)对果胶得率的影响最大，A(料液比)对果胶得率的影响最小。因素影响效果由大到小为：B(pH)>C(超声温度)>D(超声时间)>A(料液比)。

又由于A列中K2>K1>K3；B列中K2>K1>K3；C列中K2>K3>K1；D列中K2>K3>K1。因此，经正交试验获得的最优方案为B2C2D2A2，即在超声温度70 ℃、pH 1.5、超声时间40 min、料液比1∶15的条件下获得较多的果胶。

表3 方差分析表

由表3可知，P<0.05说明具有显著性，P<0.01说明非常具有显著性，因此料液比对果胶提取率具有显著性影响，而pH、超声温度和超声时间对果胶提取率具有非常显著性影响。

2.3 验证试验

在正交试验中得到的最优方案为B2C2D2A2，即工艺条件：料液比为1∶15，pH值为1.5，超声温度为70 ℃，超声时间为40 min。以最优方案B2C2D2A2进行3次平行试验，橘皮果胶提取率分别为22.42%、22.33%、22.54%，平均的提取率为22.43%。由于这3次结果均大于正交试验中的结果(最大为20.05%)，确定此试验结果的合理性。

3 结论

本试验采用四川青见柑橘，通过超声波辅助酸提取法从橘皮中提取果胶，在单因素试验和正交试验优化后得到最佳工艺条件为：pH 1.5，超声温度70 ℃，超声时间40 min，料液比1∶15，此时果胶提取率最大，为22.43%。4个因素的影响顺序为：pH>超声温度>超声时间>料液比。该试验方法条件易控制，成本较低，提取效果好。

通过本试验研究，为橘皮果胶提取提供了理论依据，同时为综合利用橘皮副产物在其他领域应用提供了理论参考[13]，如柑橘醋类黄酮化合物生物技术研究[14]、橘皮发酵汁抗氧化性及风味成分研究[15]，为柑橘副产物的多元化、功能化发展提供了技术支撑，增强了柑橘产业的市场竞争力和经济效益。