基于细菌多样性对蔬菜发酵制品分析评价

王倩倩，邱泳明，迟雪梅，贾倩雯，任楠楠，迟乃玉，张庆芳*

(1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622)

草菇(Volvariellavolvacea(Bull.ex Fr.) Sing.)肉质脆嫩，味道鲜美，维生素含量高，并富含多种氨基酸和矿物质元素[1-2]；白菜(Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.)又称“百菜之王”，营养价值高，已发现白菜中含有预防肿瘤的成分[3]。发酵制品是利用益生菌发酵而成的一类特殊食品，以其独特的风味和多种保健功能而越来越受到消费者欢迎。多种微生物在发酵制品的发酵过程中扮演着重要角色，其能将原料中的蛋白质分解为氨基酸和多肽，将脂肪分解为短链的挥发性脂肪酸和酯类物质[4-5]，微生物的代谢产物与原料分解产物共同形成了发酵制品特有的风味和品质特征。临床研究证实发酵制品中特有的益生菌[6]对胃肠疾病和过敏性疾病有积极的作用；研究显示益生菌还可用于治疗肥胖症、胰岛素抵抗综合征、Ⅱ型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。乳酸菌作为发酵制品中最为丰富的菌群[7]，不仅能改善食品的品质和营养，还具有降低胆固醇、防止乳糖不耐受症、止腹泻、抗肿瘤、抗变异原、增强免疫力、清除自由基和延缓衰老等重要功能。

本研究采用白菜和草菇为基本原料，添加蜂蜜(或冰糖)及食盐，进行接种乳酸菌(或添加酸奶，或自然发酵)，见表1。在相同工艺条件下制作发酵制品，根据感官评价和相关的理化指标，从12个发酵制品中，挑选出4种最佳发酵产品，序号为1号(BC4)、2号(BC1)、7号(XG12)、8号(XG10)，进行16S rDNA高通量测序；分析微生物的多样性及潜在功能，为发酵制品的安全与营养提供了理论依据，用以评价蔬菜发酵制品的品质；同时也为其更进一步作为益生菌饮料[8]的生产和开发等提供了理论指导。

表1 蔬菜发酵制品配方Table 1 The formula of fermented vegetable products

1 材料与方法

1.1 实验材料

辽宁省海洋微生物工程技术中心培育的新鲜草菇、市售新鲜白菜(大连91-12)、蜂蜜(购于超市)、锦州双八乳业有限公司生产的新鲜酸奶(含有Lactobacillusbulgaricus和Streptococcusthermophilus，按1∶1的比例)。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵制品的制备

挑选草菇和鲜嫩、无枯叶、无病叶的白菜，用流水清洗，切碎成小块(1 cm宽)；在90 ℃热水中烫漂10 min；将处理好的100 g草菇、白菜在火焰旁分别装入消毒后的广口瓶中，加入10 g蜂蜜、0.5%的盐，最后加入300 mL水；设置不同处理(即不添加，添加5%酸奶)；补水至瓶口；盖上磨口的瓶盖，用封口膜密封。将其放置在地下室柜中，避光，发酵温度为17 ℃，发酵周期为30 d。4种发酵制品代号分别为BC1、BC4、XG10、XG12，配方见表2。

表2 草菇和白菜发酵制品配方

1.2.2 亚硝酸盐残留量的测定

采用盐酸萘乙二胺法[9]。

1.2.3 pH值的测定

使用精密pH计直接读数。

1.2.4 糖度的测定

使用糖度计直接读数。

1.2.5 发酵制品基因组DNA的提取

发酵制品基因组DNA的提取方法参见文献[10]，DNA样品经纯化后进行PCR扩增。

1.2.6 发酵制品16S rDNA测序

细菌多样性研究主要是基于16S rDNA(V3+V4)区。细菌V3+V4扩增采用的引物：338F： 5′-ACTCCTA-CGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′F，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，对于建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 Illumina HiSeq 2500进行测序。测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.2.7 生物信息分析流程

数据预处理：根据PE reads之间的Overlap关系，将HiSeq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags，同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控过滤[11]。

信息分析内容：使用QIIME(Version 1.8.0)软件中的Uclust[12]Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，并基于Silva(细菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释；使用Mothur(Version v.1.30)软件[13]对样品Alpha多样性指数进行评估；利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图；使用PICRUSt软件通过比对16S rDNA测序数据获得物种组成信息。

2 结果与分析

2.1 样本测序数据质量评估

通过高通量测序平台，得到Raw Tags，按测序数据质量[14]要求处理后，对序列进行组装拼接，得到Clean Tags序列，各样品测序数据结果见表3。

表3 样品测序结果统计Table 3 The statistics of sample sequencing results

2.2 基于OTU的Venn图分析

在97%的相似度水平下，聚类成可操作分类单元(OTU)，通过聚类BC1、BC4、XG10和XG12样品各得到52，12，16，21个OTU。利用Venn图[15]可以展示样品之间共有、特有OTU数目，直观地表现出样品间OTU的重合情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的共有菌群。

图1 OTU-Venn图

由图1可知，OUT数在4个制品之间共有10个，样品BC1和BC4之间共有12个，样品BC1和XG10之间共有13个，样品BC4和XG12之间共有10个，样品XG10和XG12之间共有14个；样品BC1特有34个，样品BC4特有0个，样品XG10特有2个，样品XG12特有4个。

2.3 Alpha多样性分析

为比较样品间的多样性指数，分析时将样品所含序列数进行标准化。在97%相似度水平下，各样品Alpha多样性指数值统计见表4。Chao1和Ace值越大，说明样品的物种丰度越大。Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高。

表4 Alpha多样性指数统计

由表4可知，ACE指数BC1>XG12>BC4>XG10，Chao1指数BC1>XG12>XG10>BC4，因此可知，添加酸奶的白菜发酵制品的物种丰度极显著大于其他3种发酵制品的物种丰度，在草菇制品中，自然发酵制品的物种丰度大于添加酸奶制品的物种丰度；Shannon指数XG10>XG12>BC1>BC4，Simpson指数XG10

2.4 物种组成与结构分析

将OTU的代表序列与细菌参考数据库进行比对可得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计各样品群落组成。

2.4.1 属等级分类

表5样品中主要微生物属组成

在属等级上，BC1注释得到36个属，BC4注释得到9个属，XG10注释得到12个属，XG12注释得到16个属。由表5可知，4种样品中优势菌属均为Lactobacillus，所占比例分别为88.97%、90.65%、67.63%、69.46%，Leuconostoc在XG10和XG12中比例分别为29.51%和30.10%，两种菌属在4种样品中的累计相对含量分别为90.24%、94.69%、97.15%、99.56%，均高于90%。

2.4.2 种等级分类

在种等级上，BC1注释得到27个种，BC4注释得到5个种，XG10注释得到6个种，XG12注释得到9个种。

表6 样品中主要微生物种组成Table 6 The composition of main microbial species in the samples %

由表6可知，4种样品中优势菌种均为Lactobacillusplantarum，所占比例分别为88.84%、90.65%、67.63%和69.46%，Leuconostocpseudomesenteroides在4种样品中所占比例分别为1.27%、4.04%、29.51%和30.10%，unculturedBacteriumgStreptococcus在4种样品中所占比例分别为1.63%、0%、1.91%和0.02%，其余种比例在BC1、BC4、XG10和XG12中均低于0.50%。

2.5 16S功能基因预测分析

使用PICRUSt比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异[16]。

2.5.1 COG功能预测

同等原料的2个发酵制品COG功能预测比较结果见图2和图3。

由图2和图3可知，影响发酵制品营养的功能代谢途径有多项显示，如碳水化合物代谢组、氨基酸代谢组、能量代谢组、辅助因子和维生素代谢组及运输和分解代谢组等。由图2可知，BC1与BC4之间，在菌群群落的功能分布及所占丰度上存在显著性差异和变化，各功能项上BC1显著性大于BC4的为16项，BC4显著性大于BC1的为5项；由图3可知，XG10与XG12之间，在菌群群落的功能分布及所占丰度上也存在差异和变化，各功能项上XG10显著性大于XG12的为8项，XG12显著性大于XG10的为2项，说明添加酸奶对发酵制品的COG功能影响较大。

图2 样品BC1、BC4的COG功能分类统计图Fig.2 COG function classification statistics of BC1 and BC4 samples

图3 样品XG10、XG12的COG功能分类统计图Fig.3 COG function classification statistics of XG10 and XG12 samples

2.5.2 KEGG功能预测

同等原料的2个发酵制品KEGG功能预测比较结果见图4和图5。

图4 样品BC1、BC4间KEGG代谢途径的差异分析图Fig.4 Differential analysis of KEGG metabolic pathway between BC1 and BC4 samples

图5 样品XG10、XG12间KEGG代谢途径的差异分析图Fig.5 Differential analysis of KEGG metabolic pathways between XG10 and XG12 samples

由图4和图5可知，除了碳水化合物的运输与代谢与氨基酸代谢等在样品中的表达较强之外，传染病、癌症等影响样品安全的功能代谢途径非常少而且表达水平低。由图4可知，BC1与BC4之间，在菌群群落的功能分布及所占丰度上存在显著性差异和变化，各功能项上BC1显著性大于BC4的为21项，BC4显著性大于BC1的为7项；由图5可知，XG10与XG12之间，在菌群群落的功能分布及所占丰度上也存在差异和变化，各功能项上XG10显著性大于XG12的为8项，XG12显著性大于XG10的为3项，说明添加酸奶对发酵制品的KEGG功能影响较大。

3 讨论

本研究发现草菇和白菜发酵制品中主要菌群都为益生菌中的乳酸菌。草菇发酵制品中，无论是添加酸奶还是自然发酵，其优势菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶发酵：67.63%、自然发酵：69.46%)和Leuconostocpseudomesenteroides(添加酸奶发酵：29.51%、自然发酵：30.10%)。白菜发酵制品中，无论是添加酸奶还是自然发酵，其优势菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶发酵：88.97%、自然发酵：90.65%)，也有Leuconostocpseudomesenteroides，但比例较少(添加酸奶发酵：1.27%、自然发酵：4.04%)。因此发现白菜发酵制品中Lactobacillusplantarum所占比例远高于草菇发酵制品，草菇发酵制品中Leuconostocpseudomesenteroides所占比例远高于白菜发酵制品。近年来研究发现，Lactobacillusplantarum具有降解亚硝酸盐功能，能够降低亚硝胺的致癌性；临床实验证实Lactobacillusplantarum对Ⅱ型糖尿病治疗起辅助作用，可以使葡萄糖和同型半胱氨酸水平显著降低；可以降低人体身体质量指数(BMI)和动脉血压值；可以改善乳糖消化和耐受性，对腹泻和胃肠胀气有明显的改善作用，还可以改善肠黏膜屏障的完整性并减少感染并发症等[17]；在蔬菜发酵制品中Lactobacillusplantarum可以从蔬菜的膳食纤维中制造短链脂肪酸，可以诱导结肠癌细胞的凋亡，可能有助于预防结肠癌[18]。Leuconostocpseudomesenteroides是得到美国FDA认可的GRAS菌[19]，又称风味菌、香气菌和产香菌，具有改善人体肠道环境，抑制某些病原菌等功能[20]。因此，本实验研究的草菇和白菜发酵制品都适合作为益生菌饮料产品。

本研究发酵制品基于高通量测序得到注释的细菌属、种主要为益生菌中的乳酸菌，占比达90%。除此以外，有可能影响产品安全的细菌占比极低或不能培养(见表5和表6)，对产品不构成影响。因此，从主要微生物属、种组成方面也说明了本研究的发酵制品具有安全性，再者本研究发酵制品的KEGG功能预测得到的结果(见图4和图5)也显示，影响发酵制品安全的功能代谢途径显示的非常少而且水平低。

白菜是属于含有大量硝酸盐的蔬菜[21]。在白菜发酵过程中，因发酵初期会有产硝酸盐还原酶的菌存在，从而将硝酸盐大量地还原成亚硝酸盐，NO2-能与蛋白质代谢物反应生成强致癌物亚硝胺。本实验室及其他学者[22]研究发现Lactobacillusplantarum具有亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，NiR)基因，能在NO2-的诱导下产生NiR；Lactobacillusplantarum降解NO2-的途径为产NH3途径，最终产物为NH3。环境pH值>4.5时，主要是在NiR作用下分解亚硝酸盐。Lactobacillusplantarum属于同型乳酸发酵，产酸能力较强，能快速使环境pH值<4.0，从而迅速进入NO2-被H+降解阶段[23]。草菇是属于含极少量硝酸盐的蕈菌[24]，其发酵制品中亚硝酸盐含量也少。可能也是本研究的发酵制品中亚硝酸盐含量都低的原因(国家限量标准<20 mg/kg)，见表7。

表7 草菇和白菜发酵制品中NO2-残留量Table 7 NO2- residues in fermented products of Volvariella volvacea and cabbage mg/kg

通过分析OTU聚类数、丰度指数、物种注释数，其中BC1数值均高于其他样品，但发酵制品中优势菌群仍主要为乳酸菌。分析原因：白菜中含有大量的硝酸盐作为氮源，添加蜂蜜提高了碳源的量，致使发酵环境中存在大量的氮源和碳源及合适的碳氮比，添加的酸奶中富含半乳糖和乳酸、小的肽链和氨基酸、脂肪酸等大量营养因子和乳酸菌等；富集的营养条件使发酵前期各种细菌生长旺盛；导致白菜发酵前期大量硝酸盐降解产生亚硝酸盐。亚硝酸盐可作为防腐剂[25]，又抑制了大量其他菌的生长；乳酸菌本身产生的酸及乳酸菌素又能抑制发酵中的杂菌[26]；研究还认为Lactobacillusplantarum耐受亚硝酸盐的能力较强，耐酸能力较强[27]。因此，在发酵制品中检测到优势乳酸菌为Lactobacillusplantarum。在BC1中检测到亚硝化菌，亚硝化菌能使NH3生成NO2-，在H+的作用下NO2-生成NO和NO3-[28]；研究[29]中常见蔬菜发酵后期，汁液中NO3-和NO2-含量出现低频率的反复波动现象，推测可能与存在氮代谢有关的菌相关。在添加酸奶的发酵制品中还检测到了Streptococcus(白菜：1.63%、草菇：1.91%)，可能与添加的新鲜酸奶中含有Streptococcusthermophilus有关。

在COG功能预测中，BC1和BC4比较显著性差异为21项，XG10和XG12比较显著性差异为10项。在KEGG功能预测中，BC1和BC4比较显著性差异为28项，XG10和XG12比较显著性差异为11项。因此，以草菇为原料的2个制品有显著性差异的功能项数量远远少于以白菜为原料的2个制品有显著性差异的功能项数量。就功能预测指标分析及工艺成本考虑，以白菜为原料的制品，可首选BC1(添加酸奶)；以草菇为原料的制品，可首选XG12(自然发酵)。

对本研究中的草菇和白菜发酵制品，测定pH、糖度和总酸等理化指标(pH在3.1～3.4之间，糖度在8%～10%之间，总酸在0.29%～0.35%之间)，显示符合人们正常口感需要[30]，见表8。

表8 样品主要理化组成Table 8 The main physical and chemical components of samples

4 展望

本研究采用高通量测序技术对制备的草菇和白菜发酵制品进行细菌多样性分析及功能预测，在4个发酵制品中检测到的优势菌主要是对人体有临床疗效的Lactobacillusplantarum，功能预测分析发酵制品都具有安全性和营养性，发酵制品中亚硝酸盐残留量低于安全标准，糖酸比符合大众口味。综上，可以认为这4个发酵制品适合作为益生菌饮料进行产品化。