POI患者雌激素水平与外周血T淋巴细胞亚群及PD-1的相关性

王荣慧，白 云，王海青

(1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.山西省妇幼保健院/山西省儿童医院，山西 太原 030001)

早发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指女性40岁之前出现卵巢功能减退，主要表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)，血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的浓度升高及雌二醇(estradiol，E2)水平波动性下降，并伴随月经稀发及闭经症状[1]。POI在一般人群发病率为1%～5%[2]。随着社会经济的迅猛发展，女性社会精神压力增大、生育时间推后及环境等因素的综合影响，POI的发病率呈现出上升趋势且主要集中于高知识群体[3]。POI患者病情继续进展，即发展为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，POF是其终末阶段。目前发病机制尚不明确，可造成患者全身多系统疾病。因此，POI及POF的研究受到越来越多的临床关注。程序性死亡受体1(programmed-death-1，PD-1)表达于T淋巴细胞表面，是免疫抑制分子之一，当T淋巴细胞增殖、活化后，细胞表面PD-1表达量增加，并产生负向刺激信号，使得T淋巴细胞发生凋亡，功能受到抑制。本文对POI患者外周血雌二醇(E2)水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群表达量变化及PD-1表达的相关性进行研究，探讨雌激素水平变化与T淋巴细胞免疫功能的相关性。

1研究对象与方法

1.1研究对象

选取2019年12月至2021年1月就诊于山西省妇幼保健院门诊的POI患者20例为研究组，选取同期孕前健康体检妇女30例为对照组，所有研究对象的年龄为28～40岁。纳入标准：对照组妇女为月经周期规律、无高雄激素血症的临床表现及多囊卵巢样改变、无自身免疫性疾病及复发性流产史，血清FSH/LH和催乳素(prolactin，PRL)检查无异常，超声检测有正常排卵的育龄期女性；研究组患者为自然月经周期状态下，停经6个月或3个周期以上，FSH>25IU/L至少2次，间隔>4周，超声检查双侧卵巢体积小，双侧卵巢无10mm以上卵泡。排除标准：无肝肾疾病，无免疫系统或内分泌系统疾病，无恶性肿瘤及放化疗病史，无妇科及卵巢手术史，近3个月内未使用过激素类药物，2周内无感染性疾病病史。所有研究对象均知情同意，自愿完成本研究。

1.2临床资料的收集

收集资料包括：研究对象的年龄、基础疾病、妇产科病史、肿瘤病史、手术史、放化疗病史及药物使用情况。

1.3方法

1.3.1主要试剂

FITC-anti-human CD4荧光素标记单抗、PE-anti-human CD8荧光素标记单抗、PerCP/Cyanine5.5-anti-human PD-1荧光素标记单抗、PE/Cyanine5.5-anti-human CD45荧光素标记单抗(单克隆抗体均购自Biolegend公司)、溶血剂，性激素及甲状腺功能试剂盒。

1.3.2主要仪器

流式细胞仪贝克曼FC500型、Cobas e601电化学发光免疫分析仪、CentaurXP全自动化学发光免疫分析仪。

1.3.3外周血样本的采集和制备

外周血样本采集时，于清晨8时抽取空腹静脉血2管，各3mL，用EDTA抗凝。所有研究对象均需空腹8h以上，对照组于月经周期第3天采静脉血，研究组可随时采静脉血。抽血后立即进行检测，每个样本取50μL全血，加入CD4/CD8/PD-1/CD45，单抗均加入20μL，混匀后避光孵育15min，加入500μL溶血剂，振荡混匀，室温避光孵育15min，加入1mL生理盐水振荡混匀，以1 500r/min离心5min，弃上清，加入PBS重悬细胞，上机测定。性激素的检测采用Cobas e601电化学发光免疫分析仪(德国罗氏诊断有限公司)，使用上海罗氏诊断有限公司提供的试剂。甲状腺功能的检测采用CentaurXP全自动化学发光免疫分析仪(美国西门子医学诊断股份有限公司)，使用美国西门子医学诊断股份有限公司提供的试剂。血清抗缪勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)水平检测由太原金域临床检验所辅助完成。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组T淋巴细胞亚群检测情况

对照组的CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群百分比与研究组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；两组的CD4+/CD8+差异无统计学意义(P>0.05)；研究组的CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达量均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 外周血T淋巴细胞亚群及PD-1检测结果的比较Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets and PD-1 in the peripheral blood of the women between the POI group and the control

注：A正常女性CD4+T细胞百分比；B正常女性CD8+T细胞百分比；C正常女性CD4+PD-1+T细胞百分比；D正常女性CD8+PD-1+T细胞百分比；E为POI组CD4+T细胞百分比；F为POI组CD8+T细胞百分比；G正常女性CD4+PD-1+T细胞百分比；H正常女性CD8+PD-1+T细胞百分比。

2.2 POI患者外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分比及其PD-1表达量与E2水平等的相关性

POI患者血清E2水平与CD4+T淋巴细胞百分比呈正相关(r=0.530，P=0.001)，与CD8+T淋巴细胞百分比无相关性(r=-0.131，P=0.363)；血清E2水平与CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达量均呈正相关(r=0.415，P=0.003；r=0.437，P=0.000)；血清E2水平与AMH水平呈正相关(r=0.589，P<0.001)。

POI患者血清AMH水平与CD4+T淋巴细胞百分比呈正相关(r=0.504，P=0.004)，与CD8+T淋巴细胞百分比呈负相关(r=-0.430，P=0.002)；血清AMH水平与CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达量均呈正相关(r=0.415，P=0.003；r=0.649，P<0.001)。

POI患者血清促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平与CD4+T淋巴细胞百分比呈负相关(r=-0.400，P=0.004)，与CD8+T淋巴细胞百分比呈正相关(r=0.467，P=0.001)；血清TSH水平与CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达量均呈负相关(r=-0.340，P=0.016；r=-0.352，P=0.012)；血清TSH水平与AMH水平呈负相关(r=-0.484，P<0.05)。

3讨论

POI是育龄期女性中较常见的生殖障碍性疾病，发病机制复杂，大多无明确的病因。有研究表明，细胞免疫异常是POI发病的免疫学机制之一[4]。另有研究显示，女性进入绝经状态后予以雌激素替代治疗，可以调节T细胞亚群免疫平衡，改善免疫功能[5]。但目前有关POI患者T淋巴细胞亚群变化的研究较少，且结论各异，尚不能准确描述T淋巴细胞亚群数量在POI患者中的变化及作用。近年来国家调整了生育政策，保存女性生育能力日趋重要，而对POI患者进行行之有效的干预刻不容缓。

3.1 POI患者外周血T淋巴细胞亚群的变化

秦姗等[6]研究发现，POF患者CD4+T淋巴细胞含量下降，CD8+T淋巴细胞含量上升，CD4+/CD8+T降低。但Tuohy等[7]在POF患者与自身免疫的相关研究中表明，POF患者外周血中，CD4+/CD8+T明显升高。本研究显示，与正常女性相比，研究组POI患者外周血中CD4+T淋巴细胞亚群百分比下降，CD8+T淋巴细胞亚群百分比升高；但CD4+/CD8+变化无明显差异，考虑可能与样本量不足有关。

PD-1表达于T淋巴细胞表面，是免疫抑制分子之一，T淋巴细胞增殖后，PD-1表达量增加，并产生负向刺激信号，使T淋巴细胞发生凋亡，功能受到抑制。PD-1与其配体可参与自身免疫性疾病及肿瘤等多种疾病的病理进程。T淋巴细胞表面PD-1分子与其配体PD-L1结合后对T淋巴细胞功能产生负向作用，其增殖、活化能力明显降低[8]。在慢性乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染中，PD-1/PD-L1发挥着很重要的作用，在肝炎活动期PD-1表达量上调，在恢复期下调[9]，其表明PD-1的过度上调与T淋巴细胞衰竭和持续性病毒感染有关。近年来的研究集中于以PD-1为靶点，使用PD-1/PD-L1抑制剂对肿瘤进行免疫调节治疗，阻断PD-1信号通路来治疗各种肿瘤[10]，PD-1在细胞免疫功能紊乱的过程中发挥着不可或缺的作用。本研究显示，POI患者外周血T淋巴细胞表面PD-1表达量降低，考虑其细胞免疫功能紊乱与PD-1表达异常存在一定的联系。

3.2 E2与外周血T淋巴细胞数量变化及PD-1表达的相关性

雌激素水平在免疫功能调节中发挥着举足轻重的作用，女性相较于男性，其自身免疫性疾病发病率及自身免疫抗体检出率均增高。Oktem等[11]关于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的研究表明，雌激素在免疫细胞上存在同源受体ER-α和ER-β，E2可以通过同源受体调节先天和适应性免疫应答中的免疫功能。邵明君等[12]的研究中通过切除小鼠卵巢后建立绝经模型，检测其淋巴细胞及细胞因子水平发现，小鼠的E2水平与CD3+、CD4+T淋巴细胞数量变化存在相关关系，E2水平下降直接导致了T淋巴细胞各亚群数量降低。Polanczyk等[13]在人工绝经的小鼠模型中进行了有关E2与PD-1的研究，发现细胞内PD-1受体的表达与雌激素水平存在剂量依赖关系，增加小鼠体内E2水平，可导致外周血CD4+PD-1+表达量升高。Raimondi等[14]研究发现，E2可增强调节性T淋巴细胞(regulatory cells，Treg)PD-1的表达，激活Treg抑制功能。

本研究显示，POI患者血清E2水平与CD4+T淋巴细胞百分比呈正相关，与CD8+T淋巴细胞百分比无相关性，与CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达量均呈正相关，这说明POI患者体内E2水平降低可能导致T淋巴细胞表面PD-1表达量及CD4+T淋巴细胞百分比均下降。POI患者E2水平降低后，通过CD8+T淋巴细胞表面E2受体发挥免疫作用，导致CD8+PD-1+表达量下降，PD-1对CD8+T淋巴细胞的抑制作用减弱，直接导致CD8+T淋巴细胞百分比上升；而CD4+T淋巴细胞百分比上升可能与Treg对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制有关。POI疾病进展早期，E2水平因FSH升高维持于高水平阶段，同时增强Treg表面PD-1的表达[15]，Treg凋亡增加，削弱了Treg对CD4+T淋巴细胞的抑制作用，导致CD4+T淋巴细胞百分比上升，但随着卵巢功能进一步衰退，E2水平降低，导致CD4+T淋巴细胞数量下降。

3.3 TSH和AMH与外周血T淋巴细胞百分比及PD-1的相关性

在甲状腺疾病相关研究中，有学者分析了951例POF患者的临床资料，对其临床特征和发病危险因素及合并症进行分析，发现此类患者极易合并存在自身免疫性疾病史，其中以自身免疫性甲状腺炎最常见[16]。桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一种特异性自身免疫性疾病，发病过程中CD4+T淋巴细胞免疫功能紊乱，促进甲状腺抗体的产生，破坏甲状腺腺泡，引起甲状腺激素水平下降。由此可见，免疫系统紊乱极大地影响了甲状腺功能。Hu等[17]研究发现，HT发病机制与CD4+T淋巴细胞各亚群稳态失衡有关。本研究显示，POI患者血清TSH水平与CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比均具有相关关系，可考虑POI患者体内雌激素水平下降之后，T淋巴细胞亚群受雌激素水平的影响，引发CD4+T淋巴细胞免疫功能紊乱，影响了甲状腺功能，导致TSH水平上升。

综上所述，POI发病过程中，免疫功能与神经内分泌网络之间存在着复杂的联系，随着生殖医学的飞速发展，将为其发病机理的研究开辟新的途径。本研究探讨POI患者外周血E2水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群及PD-1表达量变化的关系，有助于指导临床诊疗工作，重视E2与免疫功能的相关性，尽早对POI患者进行雌激素补充治疗。