表皮生长因子对21日龄肉鸡肠道菌群多样性的影响

刘秋晨，李 娟，刘 恩，顾艳丽，王 岩，王效禹，刘 艳,，单春乔

(1 大连三仪动物药品有限公司，辽宁 大连 116000；2 江苏三仪科研质量控制中心，江苏 邳州 221300)

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是Cohen[1]在小鼠颌下腺中首次发现的，之后研究人员陆续从唾液腺、肾脏、乳腺、胎盘和十二指肠Brunner腺体等多个脏器中分离得到[2]，并最终确定EGF是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽[3]。EGF在细胞分裂增殖与凋亡[4]、肝肺损伤修复[5-6]、生殖细胞发育成熟[7]、消化道黏膜保护及损伤修复等方面都有重要作用，也与动物肠道结构和功能的完整性密切相关。EGF是肠道内环境平衡的调节因子和营养因子，具有促进胃肠上皮细胞增殖和分化的能力，并对肠细胞更新有影响[8]，而肠道上皮细胞的稳态决定了肠道结构和功能的完整性[9]。据报道，外源EGF可提升机体肠道中消化酶活力,抑制肠道有害菌定殖,从而加速上皮细胞修复、改善胃肠道疾病[10]，以提高饲料利用率和营养物质的消化吸收。用EGF喂饲感染肠致病性大肠杆菌的断奶仔兔，发现仔兔小肠各段以及结肠的病原菌定居数量明显减少，说明EGF可通过抑制致病菌的定殖而保护肠道[11]。虽然EGF在人用尤其是烧烫伤救治方面有着大量研究，但在畜禽领域相关研究较少。基于EGF在促进胃肠道上皮细胞增殖、分化及消化道黏膜发育等方面的作用，本试验研究了外源添加EGF对肉鸡肠道菌群的影响，验证EGF在促进消化道发育过程中对肠道菌群微环境的影响，旨在探讨无抗养殖背景下，EGF在抗生素替代方面的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材 料

EGF为白色粉末状，由江苏三仪科研质量控制中心提供。1日龄AA肉鸡，购自宿迁益客种禽有限公司。NucleoSpin 96 Soil DNA抽提试剂盒，购自德国Macherey-Nagel公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计，购自Thermo Fisher Scientific。

1.2 基础饲粮与饲养管理

基础饲粮参照NRC(1994年)和《中国饲料成分及营养价值表》(2018年第29版)配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。肉鸡饲养于铁丝笼中，整个饲养过程自由采食和饮水。试验第1周时每天室温保持32 ℃、光照24 h；之后室温每周降低2 ℃，直至24 ℃，每日光照23 h。所有肉鸡在7日龄和13日龄接种新城疫灭活疫苗，20日龄接种传染性法式囊灭活疫苗。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1.3 试验设计

将72只1日龄AA肉鸡随机分成对照组(CK)、K组、E组和EK组，每组3个重复，每个重复6只。CK组肉鸡饲喂基础饲粮，K组肉鸡饲喂添加250 mg/kg盐酸金霉素的饲料，E组肉鸡饲喂添加500 mg/kg EGF的饲料，EK组肉鸡饲喂添加500 mg/kg EGF和250 mg/kg盐酸金霉素的饲料。饲喂期为21 d。

1.4 样本采集

于试验结束当天(即肉鸡21日龄)每个重复随机选取1只鸡，4组共取12只鸡，屠宰后取盲肠部位，用灭菌棉线结扎后在结扎处外侧剪断。于超净台中剪开肠腔将内容物挤到5 mL冻存管中，立即放入液氮罐，冻实后-80 ℃保存备用。

1.5 肠道微生物菌群分析

使用NucleoSpin 96 Soil DNA抽提试剂盒提取样品中的DNA，用NanoDrop 2000检测DNA的浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA质量。采用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S rDNA V3～V4可变区进行PCR扩增。PCR反应体系为100 μL：2×TaqMix 50 μL，上下游引物各5 μL，模板DNA 10 μL，无酶水补足体系至100 μL。PCR程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环数30；72 ℃总延伸5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目标条带，纯化后备用。最后基于Illumina Nova测序平台进行检测定量，构建PCR-free文库。

1.5.1 可操作分类单元划分和分类地位鉴定 以 97%作为可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)序列相似度的划分阈值，该阈值大致相当于分类学中物种(species)水平的序列差异，将丰度低于全体样本测序总量0.001%的OTU去除，根据每个OTU在每个样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵。采用Greengenes数据库对OTU在门、纲、目、科、属、种水平进行分类鉴定和统计。

1.5.2 肠道群落的多样性及功能 计算Chao指数和Shannon指数，利用Wil-coxon秩和检验进行差异分析，绘制稀释曲线和等级聚类曲线。使用R软件对Weighted的UniFrac距离矩阵分别进行NMDS分析，并用二维排序图描述群落样本的结构分布。根据OTU划分和分类地位鉴定结果，获得每个样本在门、纲、目、科、属各分类水平的具体组成。利用PICRUSt算法进行基于KEGG数据库的功能预测。

1.6 统计学分析

采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析，并对试验数据进行单因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)。用GraphPad Prism 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 肉鸡肠道菌群的稀释曲线和等级聚类曲线

图1-A显示，随着测序数的增加，各组样品的稀释曲线逐渐趋于平缓，大多数样品在测序数达到50 000时稀释曲线基本变平， OTU的量基本不再增加，说明测序已经包含绝大多数样本信息。

图1 肉鸡肠道菌群的稀释曲线(A)和等级聚类曲线(B)Fig.1 Rarefaction curve(A) and rank abundance curves(B) of broiler intestinal flora

将样本中的 OTUs 按相对丰度由大到小排序编号，以OTUs的编号为横坐标，OTUs的相对丰度为纵坐标，再将这些点通过折线连接，绘制等级聚类曲线(rank abundance)。等级聚类曲线可直观地反映样本中菌种的丰富度和均匀度。菌种的丰富度由曲线在横轴上的跨度来反映，菌种的丰富度越高，曲线在横轴上的跨度越大；菌种的均匀程度由曲线在垂直方向上的平缓程度来反映，菌种分布越均匀，曲线越平缓。由图1-B可知，随着OTUs数量的增大，各曲线逐渐趋于平缓，菌种分布均匀。本研究样本的测序量和覆盖范围大，且菌种丰富，样品适合下一步的分析和研究。

2.2 EGF对肉鸡肠道菌群数量的影响

基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端(Paired-End)测序，对测序结果进行拼接，平均每样品测得88 184条tags，经过质控平均得到85 920条有效数据，质控有效数据量达64 453，质控有效率达73.09%。以97%的相似性(Identity)为划分阈值将序列聚类成为OTUs，共得到1 773个OTUs，如图2所示。

重叠部分的数字代表组间共有的OTUs个数，非重叠部分的数字代表组内特有OTUs个数The numbers in overlapping parts represent numbers of OTUs shared between groups,and the numbers in non-overlapping parts represent the number of unique OTUs in the group图2 肉鸡肠道菌群组间OTU分布差异韦恩图Fig.2 Venn diagram of OTU distribution difference between broiler intestinal bacteria groups

由图2可以看出，各组OTUs总数分别为：CK组833个，K组816个，E组1 107个，EK组1 164个。CK、K、EK和E组共有的 OTUs有319个，独有的OTUs分别为157，112，200和164个。结果表明，无论是OUTs总数还是独有的OTUs数量，E组的菌种数量较CK组、K组高，而与EK组的数量接近，说明EGF对丰富肠道菌群数量有一定促进作用。

2.3 EGF对肉鸡肠道菌种组成及其丰度的影响

2.3.1 门水平上的细菌组成 如图3所示，在门水平上占主导地位的微生物主要为厚壁菌门、变形菌门。从门水平上不同处理组菌群组成的相对丰度图可清楚区分21日龄肉鸡肠道的优势菌群，平均丰度排名前10的有：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门、未确定菌门、脱硫杆菌门、梭杆菌门、蓝细菌门和其他。本试验发现，E组中厚壁菌门微生物含量最高，而K和CK组变形菌门微生物含量最高且两组相当；相较于其他3组，E组肠道微生物菌群结构更好。

图3 肉鸡肠道菌群门水平细菌群落结构及分布Fig.3 Bacterial community structure and distribution of broiler intestinal flora at the phylum level

2.3.2 属水平上的细菌组成 在属水平上选取最丰富的35种菌属进行对比分析，结果如图4所示。

图4 肉鸡肠道菌群属水平细菌群落结构及分布Fig.4 Structure and distribution of horizontal bacterial community in broiler intestinal flora

从图4可知，E组丰度较高的细菌为：乳杆菌属、拟杆菌属、土孢杆菌属和梭菌属。与其他3组进行比较后发现，E组肉鸡肠道菌群中的乳杆菌属细菌数量显著高于CK组(P<0.05)，极显著高于K和EK组(P<0.01)。E组埃希氏菌属志贺氏菌含量显著低于EK和CK组(P<0.05)，极显著低于K组(P<0.01)。

2.3.3 种水平上的细菌组成 如图5所示，21日龄肉鸡肠道菌群在种水平上排名前10的优势菌种为：大肠杆菌、约氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、盲肠球菌、克雷伯氏菌、另枝菌属CHKCI003、鼠乳杆菌。与其他3组相比，E组肉鸡肠道中大肠杆菌数丰度显著降低，乳酸菌丰度显著升高。

图5 肉鸡肠道菌群种水平细菌群落结构及分布Fig.5 Bacterial community structure and distribution of broiler intestinal flora at species level

2.3.4 Alpha多样性 由图6可知，4组肉鸡肠道菌群的物种数量依次表现为EK>E>K>CK，菌种多样性指数(Shannon指数)表现为EK>E>CK>K，菌种丰富度指数(Chao指数)表现为EK>E>K>CK。结果表明， E组的菌种数、菌种多样性指数和菌种丰富度指数高于CK和K组，但无显著性差异(P>0.05)。

图6 肉鸡肠道菌群Alpha 多样性Fig.6 Alpha diversity analysis of broiler intestinal flora

2.4 肉鸡肠道菌群功能预测

为验证不同组别肉鸡肠道菌群代谢潜力的差异，采用PICRUSt 算法对肠道微生物的功能进行预测，结果(图7)获取了6大类功能(不包含未分类的)：人类疾病、环境信息处理、遗传信息处理、细胞工程、有机体系统、代谢作用。不同处理组的微生物功能也各有不同，CK组肠道微生物在遗传信息处理方面的功能较丰富；EK组在有机体系统、代谢作用和细胞工程方面的功能较丰富；E组各类功能较为均衡；K组除未分类功能外，环境信息处理功能较为丰富。

图7 肉鸡肠道菌群功能预测热图Fig.7 Heat map of broiler intestinal flora function prediction

3 讨 论

肠道是机体最重要的消化器官，担负着营养吸收、物质代谢的重要功能。除此之外，肠道也是最大的免疫器官，通过免疫刺激、生物拮抗、菌群定殖等[12-13]构建了肠道免疫屏障。肠道中的微生物群落包括细菌、真菌、古细菌、原生动物和病毒，其中细菌最为丰富。梭菌、乳酸杆菌、拟杆菌、大肠杆菌、普雷沃氏菌、假单胞菌、链球菌等是鸡肠道中最常见的细菌。有研究报道指出，新生雏鸡肠道几乎是无菌的，其肠道菌群的建立主要受到后天生存环境、饲料、用药等情况的影响[14-15]。健康的肠道菌群在肉鸡的饲料消化和营养吸收中具有重要作用，肠道菌群结构的差异会影响机体对饲料的转化效率，直接影响畜禽的健康和生产性能。因此，正常的肠道菌群对于保持最佳健康状况非常重要。实际养殖过程中，诸如舍内环境、热应激和抗生素之类的因素都会引起肠道菌群变化，从而导致家禽健康状况恶化和生产性能下降。

在仔猪上的研究显示， EGF 可减少断奶仔猪回肠和盲肠中大肠杆菌及肠球菌的数量[16]。研究表明， EGF 可抑制大鼠盲肠中大肠杆菌和需氧菌的定殖，维护肠道上皮屏障的完整性[17]；能够降低空肠弯曲杆菌的定殖并抑制大肠埃希氏菌的易位[18]。Bedford等[19]证明，EGF可以有效改善断奶仔猪的生长性能，降低抗生素的使用量。同时，EGF 也可以增加坏死性结肠炎大鼠肠道的长度，对坏死性肠炎的一系列病理变化产生修复作用[20]。然而在肉鸡方面尚无饲喂EGF的相关研究。本研究主要探讨了EGF在改善肉鸡肠道菌群平衡方面的生理功能。测序得到的各组OTUs结果表明，饲喂EGF后肉鸡肠道微生物种类数量较对照组有所增加，而抗生素组菌种数量有所下降，这与Torok等[21]、La-Ongkhum等[22]的研究结果一致。在门水平上，饲喂EGF后，肉鸡肠道中厚壁菌门含量最高，而在抗生素组和空白对照组中变形菌门占比最高。厚壁菌门有助于宿主代谢，调节脂质代谢，从而提升能量效率，是促进动物胃肠道微生物分解纤维素的优势菌群[23]。变形菌门被认为是肠道菌群失调的标志微生物，健康动物的肠道内含有变形菌门的共生细菌，当这些细菌的数量较少时，不表现出致病性，但在某些肠道环境下其会成为引发肠道炎症的微生物[24]。在种水平上，与其他3组相比，EGF组肉鸡肠道中大肠杆菌数量显著降低，乳酸菌(约氏乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等)占比显著增多。乳酸菌是肠道菌群有益菌的代表菌，乳酸菌以乳糖和葡萄糖为营养进行繁殖，通过发酵产生乳酸，可以保持肠道内的酸性环境，促进肠道蠕动、预防便秘和腹泻，还能促进消化吸收，增强免疫细胞活力[25]。本研究结果表明，肉鸡饲料中添加500 mg/kg的EGF有助于提高肉鸡肠道内菌群多样性，能改善肠道菌群结构，提高以乳酸菌为代表的厚壁菌门菌种丰度，降低以大肠杆菌为代表的变形菌门菌种含量。