改性贻贝壳固定化微生物降解海洋溢油研究

陈 钰，刘 梅，郭 靖，戎振英，竺柏康，陈庆国

（1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学石油化工与环境学院，浙江舟山 316022；3.舟山市污水处理有限公司，浙江舟山 316000）

随着石油生产、运输和使用的日益广泛，溢油污染已经成为一个重大环境问题，且对生态环境造成严重损害。溢油污染发生后，溢油在海面形成油膜阻碍海水和外部环境的物质交换，严重破坏生态环境[1-2]。在石油污染的处理众多处理方法中，与化学、物理方法相比，生物修复是彻底消除油污染的最重要途径。生物修复最常用的是微生物，但游离微生物在实际使用时会被海水冲刷稀释导致有效菌浓过低，且因苛刻多变的海洋环境影响而活性较低，极大的影响处理效果，而微生物的固定化可解决此难题。贻贝壳作为一种养殖废弃物，产量巨大，现已被作为固定剂广泛用于环境污染修复中[3-5]。已有研究表明，固定化微生物对pH 的耐受力高于游离态，且在更大温度范围内有良好的活性及更好的耐受性[1,6]，因此可将贻贝壳作为固定化载体吸附固定微生物应用于海洋溢油的降解处理中。

由于贻贝壳内表面光滑，吸附性能有待于提高，为进一步提高贻贝壳吸附固定微生物效率，需对其表面进行改性处理。而柠檬酸作为一种活化试剂，常用于生物炭的活化处理[7-8]。因此，本文借鉴生物炭的活化方法，以柠檬酸作为贻贝壳的改性剂并对其进行高温改性，探究贻贝壳在不同改性条件下作为固定化材料对石油烃降解菌的吸附固定效果，获得贻贝壳改性最优条件，同时在优化改性贻贝壳吸附固定石油烃降解菌条件基础上考察固定化微生物对原油的降解作用，评价不同环境对固定化微生物的降解效果，为改性贻贝壳固定化微生物在海洋溢油修复中的应用提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用菌种为实验室保存的海洋石油烃降解菌Alcanivorax sp.ASW-2。实验所用贻贝壳采自舟山嵊泗贻贝养殖区，使用前经过清洗后破碎处理。所用试剂均为分析纯。实验所用原油来自中化兴中石油转运（舟山）有限公司[9]。

1.2 培养基

富集培养基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g，NaCl 10 g，去离子水1 000 mL。

原油培养基：人工海水按照文献[10]配方进行配置，原油添加量为0.1～5 g·L-1。

所有培养基均在高压蒸汽121 ℃灭菌20 min 后使用，接种后的培养基均在锥形瓶中，置于摇床中120 r·min-1恒温培养。

1.3 实验方法

1.3.1 贻贝壳改性条件设定

对破碎的贻贝壳在柠檬酸中浸泡活化，活化一段时间后，经蒸馏水清洗再烘干，然后将活化后贻贝壳置于充氮保护的管式马弗炉中进行高温改性。采用单因素单水平试验进行贻贝壳的改性条件优化。选择柠檬酸浓度梯度为0.2%～3.5%，柠檬酸活化时间设为0.25～2 h，设定不同改性温度（100～1 000 ℃）与改性时间（0.5～2.5 h）[7]，通过不同贻贝壳样品对菌悬浊液的吸附前后吸光度改变量为评价指标进行优化。具体步骤如下：将石油烃降解菌ASW-2 在肉汤培养基中富集培养3 d 后离心去除培养基，制成OD660为0.8 的菌悬液。将制备的改性贻贝壳样品置于50 mL 菌悬浊液，摇床振荡吸附12 h 后，静置1 h 后取上层清液测定吸光度。

将不同改性后的贻贝壳样品进行扫描电镜（德国蔡司EVO 18 扫描电镜）与红外光谱分析（美国热电，Nicolet6700 红外光谱仪），探究改性前后贻贝壳的结构与性能变化，确定最佳改性条件。

1.3.2 改性贻贝壳固定化微生物性能评价

将一定量改性贻贝壳置于OD660为0.8 的菌悬浊液中，振荡吸附一定时间后，过滤分离，使用无菌人工海水冲洗2 次，即得固定化微生物。利用单因素优化法，设定改性贻贝壳不同投加量（0.2～2.5 g）和吸附时间（2～30 h），通过改性贻贝壳投加前后菌悬浊液的吸光度变化确定最优的改性贻贝壳载体用量和微生物吸附固定时间[11]。

1.3.3 固定化微生物降解石油的影响因素实验

将固定化微生物在优化改性条件的基础上，采用单因素法优化固定化微生物在不同盐度（0～40）、降解时间（1～13 d）、pH（6～9）、温度（5～35 ℃）、原油浓度（0.1～5 g·L-1）条件下的降解效率，同时进行游离微生物降解实验做对比。为考察贻贝壳对原油的吸附能力，在不同改性贻贝壳用量（0.5～2.5 g）及不同原油浓度（0.1～5 g·L-1）下测定改性贻贝壳对原油的吸附率。原油浓度测定采用紫外分光光度法，波长为225 nm，所用萃取剂为60～90 ℃的脱芳石油醚[12]。

单看国内市场，其实不难发现在长达几个月的时间内，国内方面所能提供的上涨动力一直都不够强硬，更多的是为高价尿素提供支撑作用。

1.3.4 固定化微生物对石油中主要饱和烃和芳烃组分的效果评价

为考察固定化微生物对石油中主要的饱和烃和芳烃的利用情况，并与游离微生物作对比，分别对固定化微生物和游离微生物降解不同原油（0.1～5 g·L-1）前后的原油样品参考文献[13]方法对原油中主要的烷烃和芳烃组分进行分离。采用氧化铝层析柱进行分离，分别利用正己烷、正己烷和二氯甲烷混合液（体积比为1:3）对饱和烃洗和芳烃分别进行洗脱，分离得到的样品挥发溶剂至恒重后进行称量。对主要的饱和烃和芳烃的利用作为参照。

所有实验均设3 次平行实验，实验数据结果为平均值，每组均设空白对照组。

2 结果与讨论

2.1 改性贻贝壳制备条件优化

2.1.1 柠檬酸浓度与活化时间对固定化载体吸附效果的影响

考察了柠檬酸浓度、浸泡时间对固定化载体吸附率的影响，结果如图1 所示。由图1 可以看出，柠檬酸对贻贝壳的改性效果随着柠檬酸浓度的上升而增强，在3%时吸附效果最好，浓度高于3%有下降趋势。原因可能是随着柠檬酸浓度增加酸性增强，该有机酸与贻贝壳表面的碳酸钙反应形成新的微孔使其吸附性能上升。且柠檬酸改性后贻贝壳表面的含氧官能团种类和数目增加，会提高其对石油的吸附能力[7]，但柠檬酸浓度过高强酸可能会破坏骨架结构导致吸附效率下降。GUO Junyuan,et al[14]利用过硫酸盐活化生物炭去除苯并（a）芘的研究结果与本文类似。

图1 柠檬酸浓度、浸泡时间对固定化载体吸附效率的影响Fig.1 Effect of citric acid concentration and soaking time on adsorption efficiency of immobilized carrier

随着柠檬酸浸泡时间的增加（＜1 h），改性贻贝壳表面孔隙率增大，其对微生物的吸附率也增大，但随着浸泡时间延长（＞1 h），贻贝壳表面孔隙率持续增大，破坏了贝壳本身的碳骨架结构，反而不利于贻贝壳的吸附，使其吸附性能下降。

2.1.2 碳化温度与碳化时间对固定化载体吸附效果的影响

如图2 所示，随着碳化温度的升高，改性贻贝壳的吸附效率出现多次的波动变化，这应该是与贻贝壳升温过程的结构变化有关。但在较低的碳化温度（300 ℃）时，改性贻贝壳对微生物的吸附效果即达到最佳，因此选择300 ℃为改性贻贝壳的碳化温度。贻贝壳随碳化时间延长吸附效率先上升后下降，碳化时间为30 min 时，改性贻贝壳对微生物的吸附效果最好，原因可能是贻贝壳随着碳化时间增加，平均孔径和气孔率降低，从而降低了贻贝壳的吸附能力[15]。

图2 碳化温度和碳化时间对固定化载体吸附效率的影响Fig.2 Effect of carbonization temperature and carbonization time on adsorption efficiency of immobilized carrier

如图3 所示，100～300 ℃温度升高，贻贝外壳结构逐渐松散，呈现明显的层状文石结构，比表面积显著增加，孔隙率增大，可为微生物的代谢生长提供足够的空间[16]，使得改性贻贝外壳的吸附性能不断提升。当温度在500～1 000 ℃之间时，贻贝壳中的有机质成分被大量消耗，高温使贻贝的钙质外壳由文石结构转化为光滑致密的碳酸钙结构，使得改性贻贝壳的吸附性能急剧下降，这与其吸附性能的变化相吻合。

图4 为柠檬酸活化后改性贻贝壳样品与未改性、直接高温改性的贻贝壳对照样品红外光谱图。在1 458 cm-1左右的强峰是C-N、C=O 的伸缩振动峰，该吸收峰变得更宽意味着贻贝壳内蛋白质等有机成分的不断分解使成分越来越复杂。2 978 cm-1、2 870 cm-1分别为不饱和键上C-H 不对称伸缩振动和对称伸缩振动峰，879 cm-1、710 cm-1左右出现的较强吸收峰为不饱和键上的C-H 面外弯曲振动峰，在柠檬酸活化后改性贻贝壳样品中都比改性、直接高温改性的贻贝壳样品中的吸收峰增强，说明在柠檬酸活化后改性贻贝壳样品中不饱和键显著增多，活性官能团增多。2 515 cm-1、879 cm-1分别为文石CO32-的C-O 键的不对称伸缩振动峰和面外弯曲振动吸收峰，都有显著增大，说明柠檬酸活化后改性贻贝壳样品中文石成分要多于未改性、直接高温改性的贻贝壳样品，即文石的含量增大可使其吸附性能增强[16]。

2.2 固定化载体对微生物和原油的吸附研究

2.2.1 固定化载体质量和固定化时间对改性贻贝壳吸附固定化微生物的影响

固定化载体改性贻贝壳的添加量和吸附固定化时间对改性贻贝壳吸附固定微生物的影响如图5 所示。随着载体质量的增加，改性贻贝壳对降解菌ASW-2 吸附率也随之增加。但0.5～2.5g·L-1投加量，微生物吸附率从52.82%至56.27%缓慢递增，考虑到成本，选择0.5 g·L-1的固定化载体投加量。随着吸附时间延长（2～30 h），改性贻贝壳对降解菌ASW-2 吸附率先快速上升，到12 h 后趋于稳定，因此确定12 h 为载体吸附固定化微生物的最佳吸附时间，本实验结果与张秀霞等人[17]的研究结果一致。

图5 固定化载体质量与吸附时间对降解菌吸附固定化效果的影响Fig.5 Effect of carrier mass and adsorption time on adsorption and immobilization of degrading bacteria

2.2.2 固定化载体添加量与原油含量对固定化载体原油吸附率的影响

固定化载体添加量和原油含量对固定化载体原油吸附率的影响如图6 所示。固定化载体对油吸附的贡献较小[18]，随着载体用量的增加，虽然原油的吸附量也在增加，2.5 g·L-1载体吸附量也仅为7.36%。随着原油含量的增加，固定化载体对原油吸附率先增加再趋于平缓，后继续增加，总体呈上升趋势，5 g·L-1原油吸附率也只有7.06%。在现有的实验条件中，固定化载体对原油的吸附率均不高于8%。

图6 固定化载体添加量与原油含量对固定化材料吸附原油效率的影响Fig.6 Effects of the amount of immobilized carrier and crude oil content on the adsorption efficiency of crude oil by immobilized materials

2.3 固定化微生物降解溢油的影响因素优化

2.3.1 降解时间和原油浓度对固定化微生物除油效果的影响

降解时间和原油浓度对游离微生物与固定化微生物降解影响如图7 所示。当原油浓度为在1 g·L-1时，经过7 d 的生物降解之后，其降解率进入稳定阶段。已有研究表明，利用生物炭固定化微生物去除柴油是也在7 d 的效率达到高值[19]。因此本文选择7 d 作为最佳的降解时间。固定化和游离微生物对原油的降解率随原油浓度的升高而显著降低。原因可能是原油初始浓度低时，培养基表面原油覆盖率较少，降解菌可与氧气充分接触使原油降解效果较好[20]。且原油浓度增大会使表面原油覆盖面积增大，影响氧气的传递，使固定化微生物因缺氧而无法生长繁殖[21]。而原油浓度为1 g·L-1时，贻贝壳固定化对微生物的利用原油效率提升作用最为显著，降解率提升可达24.61%，因此选择1g·L-1原油浓度作为后续实验条件。

图7 原油浓度和降解时间对固定化和游离微生物降解原油的影响Fig.7 Effect of crude oil concentration and degradation time on degradation of crude oil by free and immobilized microorganisms

2.3.2 环境条件对固定化微生物降解原油效果的影响

环境温度、pH、盐度对固定化微生物降解影响如图8 所示。随盐度增加，原油降解率呈先上升后降低的趋势，在盐度为30 时，固定化与游离微生物降解率均达到最大值，这与该菌初始生长环境有关，该菌筛选自盐度约为30 的海域。适宜的盐度促进了嗜盐微生物的生长，使固定化载体中微生物浓度增加从而提高了有机物的降解率[22]。固定化微生物和游离微生物在pH 为8 时降解率达到最大值。已有文献报道生物炭固定化微生物对石油烃的降解研究[23-24]也表明石油烃降解微生物适宜pH 范围为中性和弱碱性环境。固定化微生物和游离微生物均于25 ℃时具有最高的油降解水平，分别为81.03%、60.47%。温度过高会加速微生物体内酶蛋白的变性，使酶失活；温度过低也会限制微生物的酶活性[25-26]。固定化微生物降解溢油时，改性贻贝壳对原油吸附率小于8%，主要是生物降解贡献，固定化载体的添加显著促进了生物降解，相对于游离微生物，其降解效率提高5.17%～28.66%。

图8 环境因素（盐度、温度、pH）对固定化和游离微生物降解原油的影响Fig.8 Effect of environmental factors（salinity,temperature,pH）on crude oil degradation by immobilized and free microorganisms

2.4 固定化与游离微生物对原油中主要组分的去除对比

游离微生物与固定化微生物对不同浓度原油样品（0.1～5 g·L-1）中饱和烃和芳烃组分去除效果如图9 所示。降解菌AS-2 对饱和烷烃和芳烃均有一定降解去除效果，但随着原油浓度升高而显著下降，这与图7 中的趋势相同。降解菌AS-2 对饱和烃的降解作用显著高于芳烃，而改性贻贝壳固定化微生物对饱和烃和芳烃的降解作用均高于游离微生物。已有研究表明，经固定化处理过的微生物对原油中的正构烷烃与多环芳烃降解力高于游离的微生物[27]。而改性贻贝壳固定化微生物也显著提高了细菌对饱和烷烃和芳烃的去除率。改性贻贝壳固定化微生物对饱和烃去除率最高可提高21.61%，对芳烃去除率最高可提升11.92%。改性贻贝壳固定化材料对饱和烃的生物降解提升效果高于芳烃，这可能与芳烃相对于饱和烃毒性更大，更难被微生物利用有关。

图9 固定化微生物与游离微生物对原油中主要组分的去除效率对比Fig.9 Comparison of removal efficiency of main components in crude oil by immobilized microorganisms and free microorganisms

3 结论

本论文研究了改性贻贝壳固定化微生物对海洋溢油的降解，进行了改性贻贝壳的制备、吸附固定化微生物与微生物降解溢油条件的优化，并考察了改性贻贝壳固定化微生物对原油各组分的降解特性。主要得出以下结论：

（1）3%的柠檬酸活化1 h 的贻贝壳具有较强的吸附效果，在300 ℃下改性30 min 吸附效果最好，有较多的孔隙和对微生物较高的吸附能力。改性贻贝壳对微生物最优吸附时间为12 h，其对微生物的吸附率可达44.25%；固定化载体质量变化对吸附率的影响不显著，选取载体质量为0.5 g·L-1时，其固定化载体对微生物吸附率可达53.54%。

（2）降解时间为7 d 时得出最适原油浓度为1 g·L-1，固定化微生物降解溢油的最适环境条件盐度为30、pH 为8、温度为25 ℃。

（3）固定化微生物也显著提高了细菌对饱和烃和芳烃的去除，相对于游离微生物，其对石油降解效率提高5.17%～28.66%，固定化微生物比游离微生物表现出更好的环境耐受性。