紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽的工艺优化

余锦欣，吴学成，白 雪，蒋咏梅，章文贤

(1.福建师范大学生命科学学院， 福建 福州 350007；2.福建飞红酒业有限公司， 福建 三明 366105)

蛋白肽通常是指蛋白质经蛋白酶水解释放出来的小分子量肽[1-2]，除了易被机体消化吸收外，还具有降血压、抗菌、抗氧化、免疫活性调节等多种生物活性[3]，在营养保健品、功能性产品等领域有良好的发展前景。其制备方法主要有酸碱水解法、酶解法和微生物发酵法3种[4]。酸碱水解法氨基酸破坏严重，酶解法工艺复杂，比较而言，微生物发酵法生产的蛋白肽分子量更小、活性更高，成本也相对低廉。

芝麻粕是芝麻榨油后主要的农副产物，含有大量的优质蛋白(38%～50%)[5]，是蛋白肽的良好来源。研究者利用米曲霉[6]、枯草芽孢杆菌[7]等菌种发酵芝麻粕生产蛋白肽，袁艳超等[8]将植物乳杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种菌混合发酵芝麻粕，有效地提高了发酵液中的肽含量。目前微生物发酵法产芝麻粕蛋白肽多通过液体发酵方式，固态发酵的相关研究较少，尚未发现利用紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽的相关报道。

本研究利用紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽，加入糖类碳源物质弥补培养基碳源的不足，以肽得率为指标，通过单因素试验和正交试验对固态发酵工艺条件进行优化，为实现芝麻粕蛋白资源的高值化利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.2主要仪器 SHP-150生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司)，UV-1100紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司)，TG16-WSD台式高速离心机(湖南湘仪仪器有限公司)。

1.1.3主要材料和试剂 芝麻粕，市售；结晶牛血清蛋白，购于阿拉丁试剂有限公司；三氯乙酸、硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、碘化钾，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 培养基

1.2.1斜面培养基 PDA固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，七水硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钾3 g，维生素B10.05 g，去离子水1 L，121℃灭菌20 min。

1.2.2种子培养基 葡萄糖35 g，蛋白胨5 g，酵母精粉2.5 g，七水硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾0.1 g，维生素B10.05 g，去离子水1 L，121℃灭菌20 min。

1.2.3固态培养基 使用高速粉碎机将芝麻粕磨成粉末后过20目筛。在250 mL锥形瓶中装入芝麻粕粉末10 g，含水量为60%。后续根据需要称量一定质量比的糖类，充分溶解于去离子水中，倒入芝麻粕固态培养基中混合均匀，封口膜包扎，于121℃高压灭菌20 min。

1.3 试验方法

1.3.1固态发酵方法 接种环挑取菌丝孢子在PDA斜面培养基上划线，30℃培养7 d待菌丝长满斜面。取10 mL无菌水加入斜面，刮取孢子制成孢子悬液，转移至种子培养基(40 mL)，恒温振荡(30℃、120 r·min-1)培养2 d，倒入装有玻璃珠的无菌锥形瓶振荡打碎制得种子液。吸取2 mL种子液，均匀接种至已灭菌的芝麻粕固态发酵培养基中，31℃恒温培养6 d。

1.3.2单因素试验 以未加入碳源、未接种的芝麻粕培养基为初始培养基条件，以发酵时间6 d、含水量60%、温度31℃为初始发酵条件，所有试验均设置3次平行。(1)紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。将未接种与接种的芝麻粕培养基置于同等条件下恒温培养，以未接种的芝麻粕培养基为空白对照组，以肽得率为指标，考察紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽的能力。(2)碳源类型对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。以接种未添加碳源的芝麻粕培养基为对照组，分别添加质量比为10%的糖类碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖)，考察不同碳源类型对肽得率的影响。(3)碳源比例对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。确定最优碳源类型后，分别向芝麻粕固态培养基质中加入不同比例(5%、10%、15%、20%、25%)葡萄糖，考察不同碳源比例对肽得率的影响。(4)发酵时间对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。确定最优碳源比例后，考察发酵时间(0、2、4、6、8 d)对肽得率的影响。(5)含水量对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。确定发酵时间后，在添加碳源的芝麻粕培养基中分别以一定比例(30%、40%、50%、60%、70%)加入去离子水，考察含水量对肽得率的影响。(6)温度对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响。在确定最优含水量后，考察温度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃)对肽得率的影响。

1.3.3正交试验 在单因素试验的基础上，通过SPSS软件设计三因素三水平的正交试验，研究发酵时间、含水量、温度对肽得率的影响，得出最优组合，进行验证，确定最优发酵工艺条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.4蛋白肽的测定 固态发酵物于50℃烘48 h，磨成细粉，过60目筛。按照料液比1∶10加入发酵物粉末和蒸馏水，于160 r·min-1中振荡2 h，充分溶解其中的蛋白肽。之后于10 000 r·min-1离心15 min，收集上清液并定容。上清液用0.22 μm滤膜过滤除去菌体碎片和不溶性杂质，备用。

总之，当代计算机科学和形式化数学的发展开创了经典计算主义的时代，计算认知的思想日益深入人心，它顺应了当代科学研究活动，特别是计算机科学、信息科学、人工智能以及应用互联网技术的发展，它是新技术革命背景下诞生的新的哲学思维，无论是从理论的角度，还是从实际应用的角度，都具有重要的意义和价值。但是，在认知、计算等问题上始终存在着激烈的争议，也暴露了经典计算认知观念的局限，对那些争论问题的否定回答，将经典计算主义推向了风口浪尖，经典计算主义陷入了危机之中。

肽得率的测定：参考Ma等[9]的方法稍做调整，采用双缩脲试剂和比色法测定发酵物上清液中蛋白肽浓度，计算肽得率。取1 mL滤液，加入等体积10%的三氯乙酸(TCA)溶液，静置30 min后，于8 000 r·min-1离心15 min以去除大分子量蛋白和酸不溶性物质。再取1 mL上清液，加入4 mL双缩脲试剂进行反应，静置30 min，测定OD540，根据蛋白标准曲线计算溶液中肽浓度，换算得到发酵物中的蛋白肽总质量。肽得率为发酵物中蛋白肽总质量与培养基的质量比。

双缩脲试剂的配制：1.5 g硫酸铜和6.0 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中，搅拌加入300 mL的10%NaOH溶液，用蒸馏水定容至1 000 mL。

蛋白标准曲线的测定：参考何勇锦等[10]用结晶牛血清蛋白(BSA)配制标准蛋白溶液，用双缩脲试剂和比色法测定OD540，以BSA溶液浓度(x)为自变量，以吸光度(y)为因变量，得到标准曲线方程为：y=0.046x+0.0027。

2 结果与分析

2.1 紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图1可知，紫红曲霉发酵物中肽得率为7.34%，与未接种芝麻粕对照组相比，提高了69%，说明紫红曲霉具有丰富的蛋白酶体系，能够将胞外芝麻粕培养基中的蛋白水解为小分子量的肽，可适用于固态发酵芝麻粕生产蛋白肽。

2.2 碳源类型对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图2可知，在没有添加碳源的条件下，肽得率偏低，发酵物中的蛋白肽较少。这可能是因为脱脂芝麻粕中蛋白质含量很高，氮源丰富，但其中含碳物质的量不足[5]，影响紫红曲霉的生长，导致肽得率不高。分别添加10%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖后，肽得率均有提高，说明加入碳源均有利于芝麻蛋白肽的合成。各碳源对肽得率的促进作用依次为葡萄糖>果糖>淀粉>蔗糖>乳糖，其中葡萄糖对肽得率的影响最大，达到12.70%，与未添加碳源的芝麻粕发酵物相比提高了73%，这可能是因为在发酵初期，葡萄糖作为结构最简单的物质，可直接进入糖酵解途径，利于菌体的吸收利用。

图1 紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.1 Effect on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

图2 不同碳源类型对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.3 葡萄糖添加量对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图3可知，当培养基葡萄糖添加量为10%时，肽得率最高，可达12.93%；低于或高于10%添加量，肽得率都有所降低。这可能是因为低浓度糖类容易被紫红曲霉吸收，从而促进菌体生长，分泌更多的蛋白酶将基质中的蛋白水解成肽；当糖类浓度过高时，基质黏度增大溶氧不足，影响菌丝在培养基质内部的扩散，从而影响最终的肽得率。

图3 不同葡萄糖添加量对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.3 Effect of different glucose addition on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.4 发酵时间对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图4可知，随着发酵天数的增加，肽得率持续升高，直到第6 d达到峰值12.96%，然后趋于平缓，第8 d肽得率稍有降低，说明发酵前中期可能是酶促反应最快速的时期，发酵物中蛋白肽不断生成和积累，而由于氮源逐渐被消耗，在发酵后期这些蛋白肽可能会进入代谢循环，导致肽得率降低。因此，选择发酵时间6 d进行后续试验。

图4 发酵时间对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.5 含水量对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图5可知，当培养基含水量为50%时，肽得率最高可达14.49%。当含水量较低时，肽得率偏低，原因可能是菌丝生长和酶解反应均需要水分，而低含水量不利于菌丝生长和代谢；高含水量使得培养基过于湿润，影响基质间透气，不利于菌丝在基质内部扩散，导致部分基质未能被充分利用，从而影响蛋白肽的生成。因此，选择50%含水量进行后续试验。

图5 含水量对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.5 Effect of water content on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.6 温度对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响

由图6可知，在温度为25℃时，肽得率最低；在温度为31℃时，肽得率最高可达14.52%。这可能是因为较低的温度不利于酶解反应的进行，从而影响蛋白肽的生成；而在一定范围内较高的温度对基质中蛋白的酶解反应有促进作用，此时酶系活跃[11]，各种成分代谢旺盛。因此，选择31℃为进行后续试验。

图6 温度对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响Fig.6 Effect of temperature on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.7 正交试验结果

由表2可知，以肽得率为考察指标，从发酵时间(A)、含水量(B)、温度(C)3个因素中确定最佳发酵工艺条件。极差分析可知，3个因素对肽得率的影响强度顺序依次为B(含水量)>A(培养时间)>C(温度)。优化后的最佳组合方案为A2B2C2，即发酵时间6 d、含水量50%，温度31℃。以正交试验结果所得到的最佳发酵工艺条件进行验证试验，最终测定肽得率为14.95%，高于正交试验表格中的结果，可确定该组合是最佳试验方案。

表2 正交试验结果分析

3 讨论与结论

本研究以芝麻粕为发酵原料，采用紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽。采用单因素试验分别考察了碳源种类、碳源比例、发酵时间、含水量、温度对紫红曲霉发酵芝麻粕产蛋白肽得率的影响，通过正交试验确定最优发酵工艺条件。结果表明，碳源的加入能促进芝麻粕蛋白水解，其中葡萄糖的效果最为明显，葡萄糖添加量为10%时，肽得率最高达到12.93%，说明葡萄糖是最容易被菌丝吸收利用的营养碳源。在单因素试验的基础上，通过正交试验确定发酵时间6 d、含水量50%、温度31℃是最优发酵工艺条件，经验证后肽得率最高可达14.95%，是未接种芝麻粕基质的2.44倍，该结果高于米曲霉液体发酵芝麻粕产蛋白肽得率[5]，说明采用紫红曲霉固态发酵芝麻粕产蛋白肽的方法可行，可以为芝麻粕蛋白的高值化利用提供数据参考。