流动注射化学发光法测定水中铬实验教学改进研究*

王冬梅，叶长江，周 欢，孙恩涛

(皖南医学院检验学院，安徽 芜湖 241002)

重视实验实践教学，提高大学生创新创业能力和实际操作能力，是一流本科人才培养的重要方面[1]。实验课不仅要保证开出率，还要保证与理论课相辅相成，让学生通过实验课更好的理解运用理论知识并提高动手能力和实验技能。

化学发光法属于分子发光光谱分析法的重要分支，具有灵敏度高、线性范围宽、快速、易自动化、低成本等特点，在医药[2]、环境监测[3]、食品检验[4-5]等方面都有着广泛的应用。流动注射化学发光仪作为一种价格低，操作简便，灵敏度高的检测仪器，在各检测单位及机构十分常见，因此很多院校的仪器分析课开设了“化学发光法测定水中铬”这一实验内容。化学发光法测铬不仅灵敏度和选择性好，精密度和准确度也很有保障，通过此实验可让学生充分理解并掌握流动注射进样技术与化学发光定量分析相结合建立的一种有效痕量分析技术。但在实际教学过程中，发现传统的讲授后，学生对仪器的优势及构造认识不深，只是机械的“按方抓药”，对仪器的构造及其背后的原理理解不深刻，并不能与学过的理论知识融会贯通，学习处于被动，浮于表面，自然谈不上对实验的兴趣、热情和主动性[6]。为了加深学生对流动注射-化学发光法优势及基本原理的理解，有必要在教学环节上作一系列的设计，在课程导入、构造讲解、知识拓展等方面需要教学改进，通过结合实际案例，拆解关键组件，增加实验课的深入性、趣味性，激发学生对仪器分析实验的兴趣，亦对其他类似实验课在实验教学改进方面具有借鉴意义。

1 原实验方案

仪器分析实验“化学发光法测定水中铬”，作为化学发光法中的一个较为经典实例，在众多高等教育实验教材中均有出现。本文的实验改进以2015年出版的王伦等人主编的高等学校教材—《化学实验》(第二版)中册的实验四“流动注射化学发光法测定水中铬”为基础。

1.1 实验内容

1.1.1 试液配制

分别吸取100 μg·mL-1的铬(Ⅲ)操作液0.0、0.5 mL、 1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL及2.0 mL水样于50 mL容量瓶中，分别加入5 mL 2.5 mol·L-1KBr溶液，5 mL 1.0×10-2mol·L-1KBr溶液，二次水定容。

1.1.2 测定

仪器(示意图见图1)通电后30 min，打开测试软件，进行参数设置：调节高压至500 V，增益至1，蠕动泵采样速度为30 r/min，进样速度为25 r/min，稳定30 min。当将系统中的管路与相应的溶液接好后，在测量界面点击开始测量，系统自动运转并自动记录光强-时间曲线。仪器停止后，在数据处理界面找出光强-时间曲线中的最大峰值。

图1 流动注射化学发光分析仪示意图

每个样品平行测定三次，取平均值，绘制光强-浓度工作曲线，并计算出未知样品的铬的含量，最后用蒸馏水将仪器彻底清洗并关机。

1.2 不足之处

(1)原实验方案中只关注了仪器的操作步骤，没有对化学发光分析法的特点进行剖析。化学发光本身的特点决定了化学发光必须与流动注射进样器联用才能具有较好实用价值。因此，对于流动注射进样器的作用的分析应是本实验较为重要的内容。而原方案中没有相关内容介绍。

(2)对于仪器分析实验来说，仪器构造和工作原理是除实验基础理论以外的另一重要内容。因此，本实验中，流动注射-化学发光仪的仪器构造的详细解析是非常重要且必要的。然而，原方案中的仪器构造部分内容(图1)仅介绍了化学发光检测器的结构，而对发挥重要作用的流动注射进样器部件却未做相应介绍，十分不利于学生整体理解掌握和熟悉操作流动注射-化学发光仪。

(3)精密度反映一组数据的离散程度，是评价定量方法的一项重要性能指标。在实际评价时，常以“误差棒”的形式体现在所绘制的图中。在常见的仪器分析实验中，样品进样时的状态通常等同于样品信号采集时的状态，单个样品分析结果的离散程度普遍不高，难以清晰反映在图中。而化学发光法由于进样样品仅为信号采集体系的众多组成中的一部分，其单个样品的检测结果离散程度较大，非常适合于精密度(误差棒)的教学实践。而原方案中，仅计算了三次平均测试结果的平均值，未能充分利用该实验特点开展定量分析法的性能评价教学。

2 改进研究

2.1 流动注射进样器的导入

对于本实验内容，流动注射进样器的引入是一个重要内容。因此，进样器作用的介绍及合理的内容导入是相对重要的。鉴于此，在介绍鲁米诺在碱性条件下与过氧化氢产生的化学发光可以被部分过渡金属离子(Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)等)催化而大幅增强以后，引入鲁米诺试剂在刑事侦查上的应用介绍。利用“丝血寻凶”技术解析来阐释鲁米诺试剂参与的化学发光体系在定性分析领域的应用，同时提高学生对化学发光检测技术的学习兴趣。

在上述基础上，告诉学生化学发光定性分析应用较早而定量分析应用较晚。引导学生分析化学发光用于定量分析可能存在的问题。通过讨论得出，化学发光信号强度高度依赖于发光体系的混合状态和信号采集时间点，传统的手动进样方式难以保证上述两参数的重现性，因此用于定量分析时误差大，实际应用受到限制。

在上述背景下，介绍流动注射进样技术的定义、发展历史和工作原理。明确流动注射进样代替传统手动进样能够很好提高化学发光体系混合状态和信号采集时间点的重现性，保证定量分析的准确性。如图2，与流动注射联用后，化学发光法就能够广泛用于定量分析领域，在环境检测和卫生检验方面发挥了重要作用。

图2 流动注射-化学发光法测Cr(Ⅲ)示意图

2.2 换向阀的拆解与展示

实验所使用的仪器为流动注射-化学发光仪，主要由两个相对独立的部分组成：流动注射进样器和化学发光检测器。其中，化学发光检测器的结构比较简单，主要由光电倍增管和暗盒组成，在学习过荧光仪结构的基础上，学生是比较容易理解的。而流动注射器部分主要由蠕动泵、混合器和换向阀组成，其中前两个部件是比较容易直观理解的。因此，对于本实验来说，较好地理解换向阀的构造和工作原理是学生理解和使用整台仪器的关键所在。

为了更好地理解换向阀的结构和工作原理，其拆解和展示十分必要。因此，实验教学过程中，我们对流动注射进样器的关键部件-换向阀进行了拆解讲解，重点介绍限位点(图3A和3B)的设置及液体通路设计，让学生更好地理解左右阀位变换、阀位切换前后不同液体流动的走向。同时也捎带介绍不同部件的材质，让学生理解聚丙烯(硬塑料)和聚四氟乙烯(软塑料)的有机结合在液体流路中的密封作用。

图3 换向阀的拆解

化学发光检测器的主要构成部分为光电倍增管，可以有效地将光信号转换成电信号，从而被检测。其光学检测窗口及其配套的反应池附件的展示有助于学生更好地理解化学发光检测器的构造。如图4A所示，圆形玻璃记为光电倍增管检测窗口，其材质为石英玻璃，其正上方放置反应容器。对于静态注射-化学发光法，为了方便试剂添加，反应容器一般使用敞口玻璃皿。而在流动注射-化学发光法中，敞口玻璃皿不能自动排废液，不利于仪器自动化测试的现实。此外，皿状容器体积大，死角多，体混合状态难以控制，发光信号波动大。因此，密闭管状反应池不仅可以自动排液，还可以精准控制混合状态、保证反应体系的实时更新(图4B)。除此以外，反应池的螺旋状设计可以大大提高发光液体在检测窗口的停留时间，增大了信号强度，提高了仪器灵敏度。

图4 流通反应池的拆解

2.3 总铬含量测定内容的引入

尽管Cr(Ⅲ)是地表水中铬元素存在的重要价态，但其工业废水或受其污染的水体中铬元素通常还以另一种毒性更大的Cr(Ⅵ)价态存在。一般认为，Cr(Ⅵ)的毒性是Cr(Ⅲ)的100倍，且更易被人体所吸收而在体内蓄积，因此环境中总铬的检测更加具有现实意义。目前总铬测定的通用方法主要为原子吸收光谱法和分光光度法。其中原子吸收光谱法仪器较为昂贵，需要复杂的前处理过程。而分光光度法主要是将Cr(Ⅲ)转换成Cr(Ⅵ)后，与二苯碳酰二肼显色进行测定，灵敏度不高。化学发光法由于灵敏度高、仪器简单，能够为中小型企业和基层环境检测部门监控环境水样中总铬含量提供较大便利。

为了更好地让学生掌握化学发光法在环境检测方面的应用，实验教学中将Cr(Ⅲ)检测拓展为总铬的检测具有较好的现实意义，能够一定程度提升教学效果。因此，实验教学中，我们使用亚硫酸氢钠将工业废水中Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)[7]，进行模拟样品总铬的检测。此部分实验内容经过试做，实验现象明显，教学效果良好。

2.4 数据处理软件及相关的分析参数的熟悉

本实验的教学对象是普通本科生中的高年级学生，引导学生使用常规数据处理软件origin来对所得的实验数据进行处理、绘图对实验类本科毕业设计的顺利完成是非常有帮助的。使用化学发光进行定量检测时，通常要以多次测量取平均值的方式来提高准确性。化学发光教学实验的特性为origin作线性关系图中“误差棒”的理解和绘制提供较为理想的情境。首先通过讲解，让学生理解平均值相同的一组测量数据可以差别很大，精密度能够反映的是一组数据的一个离散程度，作图时可以以“误差棒”的形式体现出来。作图时，先让学生掌握标准差(Standard Deviation, SD)、标准误(Standard Error, SE)、置信区间(Confidence Interval, CI)是常用的误差棒的代表形式，熟悉相应的计算公式，通过计算掌握三者间的区别与联系。在上述三种表现形式中，SD是误差棒使用最多的代表形式，反映的是数据点围绕均值的分布状况。同时也应该指出，为了避免混淆，使用误差棒时应该明确指出其代表的具体概念。

除了上述误差棒的理解与掌握外，本实验教学过程中，也可以让学生进一步掌握使用origin软件来处理所得数据，绘制化学发光信号随Cr(Ⅲ)浓度增加的变化图及线性关系图。作为一种重要的科研数据处理软件，在本科中的高年级阶段逐渐强化origin使用是非常有必要的，能够提高学生在大学生创新创业项目和毕业论文写作中的数据处理和分析能力。

3 结 语

我们结合实际教学实践，对流动注射-化学发光法测水中的铬离子仪器分析实验教学进行了改进。改进后的实验能够较好激发学生对化学发光分析法的学习兴趣，加深对化学发光用于定性和定量分析的理解，使得学生能够较好理解流动注射-化学发光仪器的构造、工作原理及优势。实施于教学之后，学生反馈良好，对仪器的理解更加深入透彻。