山西连翘叶无机元素指纹图谱的建立及主成分分析*

张国香，郭俊俊

(山西省科技资源与大型仪器开放共享中心，山西 太原 030000)

连翘为木犀科连翘属落叶灌木，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效[1-2]，连翘叶是连翘的干燥叶，其茎叶与果实的成分具有一致性，连翘叶亦可药用[3]。山西是连翘道地药材生产地，果实制成中药材后，大量的连翘叶被废弃[4-5]。连翘叶不仅有抗氧化、抗衰老、抗癌、抑菌、降血糖等的功效[6-7]，而且还有丰富的营养物质，已被列为药食同源原料[8-9]。目前有关连翘叶的质量评价研究已有很多报道，主要集中在有机活性成分的研究[10-13]。研究表明，除活性成分外，中药植物体内的无机元素尤其是某些微量元素与中药材的药效有着紧密的联系[14-16]，很多药物在人体内发挥药效时需要以无机元素为基础，对药效的发挥起着协同或拮抗作用[17-18]。目前关于山西连翘叶无机元素指纹图谱的研究未见报道，因此研究和掌握连翘叶中无机元素的组成有助于其质量和安全性评价，为连翘叶资源开发利用提供一定的参考依据

本试验采用ICP-MS法测定了山西连翘10个主产区的连翘叶中13种无机元素的含量，并绘制了无机元素指纹图谱，利用夹角余弦法计算了不同地区连翘叶的相似度，采用spss22.0统计分析进行了元素相关性和主成分分析。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

Perkin Elmer NexTON 300X ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪，美国PerkinElmer公司；DigiBlock ED54电热消解仪，Lab Tech公司。

混合标准储备液，国家有色金属及电子材料分析测试中心；内标元素标准储备液，国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓硝酸(优级纯)，成都市科龙化工试剂厂；实验室用水均为超纯水。

样品：选取山西连翘主产地安泽、陵川、长子等10个县区的连翘叶，见表1。

表1 样品信息

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

将晾干的连翘叶粉碎后过60目筛，称取样品约0.5 g(精确到0.0001 g)于50 mL玻璃消解管中，加入5 mL浓硝酸加盖置于电热消解仪上，浸泡过夜，30 min升至120 ℃保持1 h， 30 min由120 ℃升至150 ℃保持1 h后，打开盖子赶酸至近干，消解结束后用2%硝酸溶液定容至25 mL，作为待测液。同时平行做空白试液。

1.2.2 ICP-MS仪器参数

电感耦合等离子体质谱仪工作条件设定：射频功率1100 W，等离子体气流速度15.0L/min，雾化气流速1.0 L/min，辅助气流速1.0 L/min，每个样品重复3次。

1.2.3 检出限

在1.2.2条件下平行测定空白溶液11次，以测定结果的 3倍标准偏差所对应的浓度值为13种元素的检测限(LOD)。

1.2.4 标准曲线

将多元素标准储备液稀释后配制成相应浓度的标准系列，按1.2.2仪器条件进行测定，采用在线内标法用三通将内标液和标准溶液混合后进入ICP-MS进行测定，绘制标准曲线，结果见表2。结果表明，各元素线性关系均良好，相关系数0.9953～0.9999。

1.2.5 精密度和回收率

称取样品(S3)约0.5 g，按1.2.1前处理和1.2.2仪器条件进行测定，连续测定6次，计算各元素含量RSD，结果见表2，方法精密度(RSD)为1.36%～7.66%，符合要求。

称取样品(S3)约0.5 g，平行制备6份，分别加入一定量的混合标准溶液按1.2.1前处理，在1.2.2仪器条件下进行测定，计算平均回收率(见表2)。各元素加标回收率88.44%～105.63%，符合要求。

表2 13种元素标准曲线相关系数、检出限、回收率和精密度

1.3 数据处理及分析

采用ICP-MS法测定元素含量，以元素种类为横坐标，相对含量为纵坐标通过Origin8.0软件绘制无机元素指纹图谱；通过SPSS22.0软件分析各元素之间的相关性和主成分分析。

1.4 指纹图谱相似度计算

利用SPSS22.0软件计算元素指纹图谱与元素标准指纹图谱之间的相似度，计算原理为夹角余弦法[19]。两向量的夹角余弦于公式(1)：

(1)

式中：X为N维向量(x1,x2,.........xn)；X·Y表示两向量的内积，|X|表示向量的模；cosα越接近1，说明两个向量越相似。

2 结果与讨论

2.1 连翘叶中无机元素的含量

10个地区连翘叶样品中13种无机元素的测定结果见表3。结果表明，连翘叶中13种无机元素含量存在一定的差异，其中含有较丰富的K、Ca、Mg人体必须的常量元素，其次含量较高的为Fe、Zn、Mn、Cu微量元素，而Se、Mo、Co、Sn元素的含量较低。同一元素在不同产地之间的含量存在较大差异，如K元素含量最高值为13160.28 μg/g，最低值为9967.23 μg/g。

表3 连翘叶中无机元素含量

续表3

为了进一步分析连翘叶中各元素之间的相关性，利用SPSS22.0计算13种元素的Pearson相关系数(表4)。结果表明不同地区连翘叶中无机元素之间存在一定的相互作用关系。Mg-K、Ni-Cu、和Se-Fe元素间达到极显著正相关，Cu-Ca、Cu-Zn、Ni-Ca、和Co-Fe元素间达到显著正相关。连翘叶中无机元素间未出现极显著或显著负相关。

表4 各元素之间的Pearson相关系数

2.2 连翘叶中无机元素指纹图谱的建立及相似度分析

由于连翘叶中13种无机元素含量差别较大，为了使无机元素指纹图谱更加直观，便于绘制，将不同元素的含量扩大或缩小至统一数量级(K缩小1000倍，Ca、Mg缩小100倍，Fe缩小10倍，Se、Sn扩大1000倍，Cu、Mn、Mo、Co、V、Ni扩大10倍)，以元素种类为横坐标，相对含量为纵坐标，绘制指纹图谱(图1A)。虽然不同地区连翘叶在元素含量上存在一定差异，但无机指纹图谱峰形相似，其走势基本一致。为了进一步比较相似度，将10个地区连翘叶样品以平均数构建连翘叶无机元素对照指纹图谱(图1B)，通过夹角余弦法计算样品与对照图谱的相似度，值越接近1，说明相似度越高。

图1 连翘叶无机元素指纹图谱(A)和无机元素对照指纹图谱(B)

采用向量夹角余弦法由公式(1)计算出10个产地连翘叶样品的无机元素指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，计算结果见表5。从表中可以看出，山西连翘叶的无机元素指纹图谱与对照图谱的相似度取值为0.983～0.999，即各连翘叶样品之间的相似度均在0.9以上，说明山西不同地区间无机指纹图谱的相似度较高。

表5 连翘叶元素指纹图谱相似度分析

2.3 连翘叶中无机元素主成分分析

进一步对10个地区连翘叶中13种无机元素进行PCA 分析(表6)。主成分分析法能够很好的从几十种元素和不同地区的样品中筛选出特征元素[20]，根据Kaiser准则(特征值大于1)及累积贡献率准则(累计贡献率一般大于85%)，前5个主成分初始特征值均大于1且累计贡献率达90.087%，说明前5个成分代表了山西10个不同地区连翘叶无机元素90%的变量信息。因此提取前5个主成分因子进行分析。前5个主成分的因子负荷量见表7，第1主成分因子负荷量较大的是Cu、Ni，第2主成分因子负荷量较大的Se、Fe，第3主成分因子负荷量较大的Mg、K，第4主成分因子负荷量较大的是V，第5主成分因子负荷量较大的是Mn。因此Cu、Ni、Se、Fe、Mg、K、V、Mn为山西连翘叶的特征无机元素。

表6 主成分初始特征值和贡献率

2.4 讨 论

本研究建立的山西连翘叶无机元素指纹图谱是对连翘叶整体质量控制的有力补充，山西连翘叶筛选出的8种特征元素，其中K、Mg是人体必需常量元素，Se增强机体免疫力，影响抗氧化系统，Fe、Mn能与药材中的有机成分形成络合物，从而起到抗菌作用，Ni影响Fe的吸收[20]。这些元素与连翘叶具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用相一致。连翘叶无机元素中有7对呈显著正相关，无显著负相关，表明连翘叶中的无机元素能很好的发挥协同作用，因此，可认为连翘叶所含的这些无机元素是其功效物质基础之一。可为探讨连翘叶药效药性的机理提供试验基础。目前关于连翘叶中药效成分与特征元素的相关性分析还需进一步研究。

3 结 论

本研究采用ICP-MS法同时测定山西连翘叶中13种无机元素，结果表明，山西连翘叶含有丰富的常量元素和人体所必需的微量元素。通过对所含无机元素的组成特点分析，建立了无机元素指纹图谱，通过PCA确定了山西连翘叶中特征元素，分别为Cu、Ni、Se、Fe、Mg、K、V、Mn，为后续研究药效之间的协同作用提供了数据参考。