七氟烷通过MAPK/STAT3信号通路诱导人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞凋亡

王世禄 马乃全 周期 符少川 衣小卓 李媛

舌癌是口腔颌面部最常见的癌症之一，且多为鳞状细胞癌[1]。口腔鳞状细胞癌发展迅猛并且对于常规化学疗法不敏感等问题，导致患者的，五年存活率低于62%，严重威胁着人们的生命和健康[2]。有研究表明，选用不同的麻醉药物，对于肿瘤的治疗会产生不同的影响，进一步影响肿瘤的转移[3]。七氟烷(sevoflurane)因其具有镇痛性强及诱导迅速等优点被广泛运用于肿瘤患者的手术治疗中[4]。目前已经被证实，七氟烷能够通过抑制肺癌A549细胞增殖、增加凋亡小体产生并激活caspase3/7等诱导肺癌A549细胞发生凋亡[5]。七氟烷通过下调MMP-9的表达，上调PKC上游信号通路，减少结肠癌细胞的体外迁移[6]。七氟烷还能够通过调控p53信号通路诱导骨肉瘤SAOS2细胞发生凋亡[7]。因此本研究通过一系列体外实验探究七氟烷对BSNQ对人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞人增殖抑制作用、诱导凋亡作用及其相关信号转导途径，进而为应用七氟烷治疗癌症提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞(中国科学院细胞研究所)；RPMI-1640液体培养基、胰蛋白酶(TE)、青霉素/链霉素双抗(P/S)、及磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone公司， 美国)；胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司， 美国)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco公司， 美国)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和细胞凋亡与坏死检测试剂盒(上海碧云天公司)；Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3(cle-cas-3)、cleaved-PARP(cle-PARP)、p38α/β、p-p38、JNK、p-JNK、ERK2、p-ERK、STAT3、p-STAT3及β-actin抗体、HRP标记山羊抗鼠/抗兔IgG(Santa Cruz公司， 美国)；p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及ERK抑制剂FR180204(上海MCE公司)、ECL化学发光试剂(Thermo公司， 美国)。

1.2 人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞的培养

人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞在含10%的FBS、100 μg/mL的链霉素及100 U/mL的青霉素的RPMI-1640液体培养基， 37 ℃ 5%、 5% CO2培养箱中孵育，待细胞达到70%～85%时进行传代。选择处于对数生长期的Tca-8113细胞进行实验。

1.3 建立七氟烷处理后细胞凋亡模型

七氟烷麻醉机进行检测后，向挥发罐中加入七氟烷试剂。随后Tca-8113细胞置于无菌特制密闭容器后，出气口与分析仪连接，进气口(5% CO2)与麻醉机进行连接。将容器放置于37 ℃恒温水浴锅中，根据实验将挥发罐旋转到指定刻度。当浓度达到实验要求时，关闭挥发罐，将容器密闭，每组处理6 h，处理完毕后，从密闭容器中取出，放入培养箱继续培养。

1.4 MTT比色法检测Tca-8113细胞的存活率

将Tca-8113细胞接种于96 孔板中(密度为1×104个细胞)，孵育24 h。待细胞贴壁后，1% FBS的RPMI-1640培养液进行血清饥饿2 h后，每孔加入1 μL不同浓度(2、 4、 6、 8、 10 μmol/L)七氟烷孵育24 h(每个浓度段均设置8 个复孔，其中溶剂对照组加入1 μL DMSO)。每孔加入15 μL的MTT，继续孵育2～4 h后。弃培养液，加入100 μL的DMSO，摇床避光混匀15 min后，酶联免疫检测仪测量吸光度(A490)值，并计算各组Tca-8113细胞的存活率。每组实验重复3次。细胞存活率=(七氟烷处理组A490值-调零组A490值)/(对照组A490值-调零组A490值)×100%。

1.5 Hochest 33342/PI双染法检测Tca-8113细胞凋亡情况

人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞接种于6 孔板内(每孔1×105个细胞)，终浓度为8 μmol/L七氟烷分别处理细胞不同时间段(3、 6、 12、 24 h)后，根据细胞凋亡与坏死检测试剂盒说明书对Tca-8113细胞进行染色，荧光显微镜下拍照，观察细胞凋亡情况。

1.6 流式细胞术检测Tca-8113细胞凋亡情况

人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞接种于6 孔板内(每孔1×105个细胞)，终浓度为8 μmol/L七氟烷分别处理细胞不同时间段(3、 6、 12、 24 h)后，收集细胞于离心管中，根据碧云天Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书要求对Tca-8113细胞进行染色，室温下避光孵育20 min后， 500 μL PBS将细胞重悬并转入流式管中，通过流式细胞仪检测细胞的早期凋亡与晚期凋亡情况。测定结果利用CytExpert 1.2软件对各时间段细胞凋亡情况进行统计。

1.7 Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白的表达

将七氟烷处理不同时间(3、 6、 12、 24 h)后的Tca-8113细胞收集于离心管中，提取蛋白，变性后上样30 μg。10%～12 %的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，半干转至NC膜上。5 %的脱脂乳室温封闭1.5 h，TBST洗涤5 次，每次5 min。加入一抗Bax、Bcl-2、cle-cas-3、cle-PARP、p38α/β、p-p38、JNK、p-JNK、ERK2、p-ERK、STAT3、p-STAT3及β-actin(稀释比例为1∶2500)，摇床孵育过夜(4 ℃)。将对应一抗收回，TBST洗涤5 次，加入二抗HRP标记山羊抗兔、抗鼠IgG室温摇床孵育2 h， ECL化学发光试剂显色，利用化学发光型凝胶成像系统照相。内参采用β-actin。ImageJ 1.42q软件进行灰度分析。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 七氟烷对Tca-8113细胞的杀伤作用

随着七氟烷处理的浓度逐渐升高(1、 3、 10、 30、 100 μmol/L)，人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞的存活率不断降低，且呈现浓度依赖性。经计算得出七氟烷的IC50值为8 μmol/L。与对照组相比具有明显差异(P<0.01)(图 1)。

图 1 七氟烷对Tca-8113细胞的杀伤作用

2.2 七氟烷对Tca-8113细胞的诱导凋亡作用

随着七氟烷处理时间的不断延长(3、 6、 12、 30、 24 h)，人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞的荧光强度逐渐增强，其细胞凋亡的水平也逐步增加，细胞在处理24 h时， 荧光强度达到最高且呈现时间依赖性(图 2A)，不同时间段处理的Tca-8113细胞组具有显著差异(P<0.01)。为了进一步确定七氟烷是否能够诱导Tca-8113细胞发生凋亡，通过流式细胞术检测处理不同时间(3、 6、 12、 24 h)后细胞凋亡情况。如图 2C所示，随着七氟烷处理时间的不断延长，Tca-8113细胞的早期凋亡与晚期凋亡数量逐渐增多，且呈现一定的时间依赖性。 此外， 从分子水平上通过Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达量变化， 随着七氟烷处理时间的不断增加，与0 h相比，Bax、cle-cas-3及cle-PARP蛋白的表达量逐渐升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低(图 2E)。

图 2 七氟烷诱导Tca-8113细胞凋亡

2.3 七氟烷通过MAPK及STAT3信号通路诱导Tca-8113细胞凋亡

为了确定七氟烷诱导Tca-8113细胞凋亡的分子机制，Western bot检测MAPK及STAT3信号通路相关蛋白的表达量变化情况。随着七氟烷处理时间的增加(3、 6、 12、 24 h)，与0 h相比， p-p38及p-JNK蛋白的表达量不断增加， p-ERK及p-STAT3蛋白的表达量逐渐降低(P<0.01)(图 3)。

图 3 七氟烷诱导Tca-8113细胞MAPK/STAT3信号通路相关蛋白表达

2.4 七氟烷通过由MAPK调控的STAT3信号通路诱导Tca-8113细胞凋亡

为了进一步确认MAPK与STAT3信号通路的关系，Tca-8113细胞预处理MAPK抑制剂后，终浓度为8 μmol/L的七氟烷处理不同时间(3、6、12、 24 h)，通过Western blot检测相关蛋白的表达量变化情况。随着七氟烷处理时间的不断延长，与七氟烷单独处理组相比，p38抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)与七氟烷共同处理组的p-p38、p-JNK、clea-cas-3和cle-PARP降低，p-STAT3及Bcl-2升高；相反，ERK抑制剂(FR180204)与七氟烷共同处理组的p-ERK、p-STAT3及Bcl-2蛋白的表达量降低，cle-cas-3及cle-PARP蛋白的表达量升高(图 4)。

图 4 七氟烷通过由MAPK调控的STAT3信号通路诱导Tca-8113细胞凋亡

以上结果表明，七氟烷通过由MAPK调控的STAT3信号通路诱导Tca-8113细胞凋亡(图 5)。

图 5 七氟烷诱导Tca-8113细胞凋亡的作用机制

3 讨 论

七氟烷是临床上常见的气体麻醉剂，以往的研究表明，七氟烷能够通过激活cleaved-caspase-3蛋白的表达，下调G2/M相关蛋白的表达量，将细胞阻滞在G2/M期，抑制肺癌A549增殖，进而使A549细胞发生凋亡[8]。此外，七氟烷作为气体麻醉剂能够通过抑制中性粒细胞MMP-9的释放，干扰CXCR2下游信号通路的表达，激活蛋白激酶C上游信号通路的表达，进而使MMP-9的表达量下降，最终降低癌细胞的体外迁移程度[6]。

本实验MTT比色法的结果中显示七氟烷能够有效地杀伤人舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞，抑制其增殖，并呈剂量依赖性。癌症的产生和治疗与细胞凋亡和细胞增殖有很大关联，细胞凋亡现象存在于大多数 肿瘤细胞中，凋亡的发生由促凋亡因子和抗凋亡因子相互调节平衡，一旦失衡，就会引发疾病的产生[9]。本实验进一步通过Hochest 33342/PI双染、流式细胞术及Western blot证明，七氟烷能够诱导人口腔舌鳞细胞癌Tca-8113细胞凋亡MAPK信号通路是调节细胞生长、增殖和凋亡等多种细胞生物进程中最经典的信号通路之一。由p38 MAPKs、JNK及ERK组成[10]。除此之外，STAT3信号通路能够将细胞外信号转移到细胞核中并诱导激活靶基因。一直以来，肿瘤的发生被认为是一个多阶段过程，因此STAT3信号通路被认为是其中的一个关键因子[11]。为了探究七氟烷诱导Tca-8113细胞凋亡的分子机制，本实验通过Western blot实验检测MAPK及STAT3信号通路相关蛋白的表达量变化情况，并进一步加入MAPK抑制剂，探究MAPK与STAT3信号通路的关系。Western blot结果显示，七氟烷通过MAPK/STAT3信号通路诱导人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞发生凋亡，并且MAPK调控STAT3信号通路。

综上所述，七氟烷有效抑制Tca-8113细胞增殖，并通过MAPK及STAT3信号通路诱导其凋亡。本实验初步探索了七氟烷诱导人口腔舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞凋亡的分子机制，为七氟烷在临床上的广泛应用提供了一定的理论支持。