小熊猫源大肠杆菌的药敏特性及致病性

李运莉 张东升 侯 蓉 岳婵娟 苏小艳 燕 霞 李 林 杨奎兴 彭 西 刘颂蕊*

(1.成都大熊猫繁育研究基地，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都，610081；2.成都大学药学院，成都，610106)

小熊猫(Ailurusfulgens)，别称红熊猫、红猫熊、九节狼、金狗，属哺乳纲(Mammalia)食肉目(Carnivora)，分布在中国、尼泊尔、不丹以及缅甸北部等地，主要栖息在海拔2 000～3 800 m的针阔混交林或有竹丛分布的常绿阔叶林中[1]，是喜马拉雅—横断山脉所特有的珍稀动物。在过去的半个世纪内，由于森林采伐、栖息地丧失及片段化、捕猎和其他人类活动的影响，我国小熊猫分布区逐渐向高山峡谷退缩，面积也大幅缩减，整个种群数量下降比例高达40%[2]。目前，小熊猫已被列为国家二级保护动物，我国已建立多个自然保护区，为小熊猫种群以及栖息地的保护提供了有效保障。

在小熊猫饲养和保护工作中，疾病防治是影响种群数量及健康的关键环节，而细菌感染是危害小熊猫种群健康的重要因素。大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种常见的存在于动物消化道内的条件致病菌，致病性大肠杆菌一旦感染宿主后，会在其体内快速繁殖，并产生一定量的特殊毒力因子，引起各种病症，包括胃肠道[3]、肺炎[4]、泌尿系统[5]、血液[6]以及中枢神经系统的疾病[7]，给畜禽业、特种经济养殖动物带来巨大的经济损失，也对野生动物群体的生命健康构成威胁。据现有文献报道，野生动物中常常发现大肠杆菌感染的情况[8]。郭定宗等[9]在1例病死金丝猴(Rhinopithecussp.)的死因研究中发现，该金丝猴是死于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和大肠杆菌混合感染导致的败血症。范光丽等[10]在对幼龄朱鹮(Nipponianippon)感染大肠杆菌死亡的研究中认为，幼龄朱鹮更易感染源自臭蛋爆裂污染及排泄物中的大肠杆菌。梅妹等[11]在2005年从134份腹泻梅花鹿(Cervusnippon)的粪便中分离鉴定得到127株大肠杆菌，所得菌株呈现出不同程度的耐药性。生长在卧龙大熊猫研究中心、雅安碧峰峡野生动物园的国宝大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)也常在9—11月大肠杆菌病流行期感染该菌[12]。

本研究针对小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌MT820501进行耐药分析，并以小鼠为受试生物，验证其致病性及损伤特征，为该类大肠杆菌病的诊断和临床用药提供科学依据，并为小熊猫细菌病的防治补充资料。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2017年11月21日分离自成都大熊猫繁育研究基地的1例死亡小熊猫肾脏中的致肾盂肾炎大肠杆菌(MT820501)。

1.2 实验动物

SPF级小鼠，共48只，体重18～22 g，雌雄各半，购买于川北医学院实验动物中心。

1.3 菌种复苏

将前期保存的菌种逐步恢复到室温，于无菌环境中吸取50～100 μL接种到脑心浸出液肉汤培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，在37 ℃恒温培养箱中，180 r/min振荡培养24 h，重复此步骤传代2～3次，获得生长活力良好的菌液。

1.4 药敏试验

用无菌生理盐水将菌液稀释至0.5个麦氏浓度，取适量菌液到MH琼脂培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)表面，涂布均匀后贴好药敏纸片(购自英国Oxoid公司及杭州微生物试剂有限公司)，37 ℃恒温培养箱中倒置培养一定时间后取出，观察结果并测量抑菌圈的直径(培养时间参照CLSI M100 2018标准，测量结果以抑菌圈直径大小作为敏感与耐药的判定指标)，抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限，以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。

1.5 小鼠致病性试验

将小鼠随机分为6组，每组8只，腹腔注射系列浓度菌液0.5 mL/只，浓度分别为 1.20×109、4.32×108、1.55×108、5.59×107、2.01×107cfu/mL，对照组注射等量灭菌生理盐水。攻毒后，各组分笼饲养(温度18～22 ℃，相对湿度50%～60%)，连续7 d观察记录各组小鼠的食欲、精神状况等临床表现，并记录各组小鼠的发病和死亡情况，计算其半数致死量。对死亡小鼠剖检，观察记录病理变化，采集各组织脏器，进行病原菌的分离；另外采集小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠道等组织，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，连续切片(厚度为5 μm)，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)，光学显微镜下观察组织病理学变化。

2 结果与分析

2.1 药敏试验结果

由表1可见：小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌MT820501对青霉素类药物(哌拉西林)、头孢菌素类药物(头孢西丁、头孢曲松、头孢吡肟)、非经典β-内酰胺类药物(美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄青霉素-舒巴坦)、氨基糖苷类药物(卡那霉素、丁胺卡那、新霉素)、四环素类药物(米诺环素)、喹诺酮类药物(左氧氟沙星)、硝基呋喃类药物(呋喃唑酮)、多肽类药物(多黏菌素B)敏感，对其余抗生素耐药。

表1 小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌MT820501的耐药表型

2.2 小鼠致病性

攻毒后6 h，高剂量组小鼠活动变得缓慢，活力下降，震颤，畏寒，喜扎堆；攻毒12 h后，开始有小鼠发病死亡。按照改良寇氏法计算其半数致死量[13]，其LD50为8.42×107cfu/mL。从死亡小鼠的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等组织中均能分离出生长形态一致的菌落，与小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌的形态特点相同。分离菌株经革兰氏染色后表现为革兰氏阴性短杆菌(图1)。分离菌株16S rDNA基因PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳显示在1 500 bp处出现特异性条带(图2)。将测序所得序列于GenBank中进行BLAST序列比对，结果显示，分离菌株与小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌(MT820501)的序列相似度为100%。

图1 小鼠体内分离菌株革兰氏染色

图2 死亡小鼠不同组织内分离菌株的16S rDNA基因PCR扩增结果

攻毒组死亡小鼠口鼻、脚趾发黑，眼角有黄色分泌物，肛周有黄褐色稀薄粪便污染。与对照组比较，剖检后的攻毒组死亡小鼠实质脏器颜色呈暗红色，表面伴有不同大小的充血出血斑块，肠段透明稀薄。病理组织学观察结果显示：心肌间质水肿增宽，组织中小静脉血管、毛细血管扩张，充满红细胞，散在中性粒细胞、淋巴细胞浸润，可见蓝色细菌团块(图3A)；肝细胞肿大，部分肝细胞脂肪变性，肝脏组织内见有大小不等的坏死灶，散见有数量不等的淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞浸润，部分肝窦中可见蓝色细菌团块(图3B)；脾脏白髓区淋巴滤泡生发中心扩大，细胞碎片增多；红髓区充血出血，有少量中性粒细胞浸润，淋巴细胞相对减少(图3C)；肺泡壁增厚，毛细血管扩张，充满红细胞，肺泡壁有炎性细胞浸润，肺泡腔内偶见漏出的红细胞及脱落的肺泡上皮细胞，支气管上的假复层柱状纤毛上皮细胞少量脱落，腔内有少量纤维素型浆液(图3D)；肾小球体积肿大、充血，肾小管上皮细胞广泛性肿大及颗粒变性，部分细胞坏死，细胞核染色较深且发生固缩，与基底膜细胞分离，严重时整个肾小管坏死，肾间质血管扩张充血，部分管腔内见细菌栓子，髓质区集合管间质充血，上皮细胞肿大、颗粒变性，散在细胞坏死现象(图3E)；胃无明显病理损伤(图3F)；整个肠段表现为肠绒毛脱落，部分固有层毛细血管扩张，充满红细胞，并伴有数量不等的炎性细胞浸润(图3G、H)。

图3 攻毒组小鼠病理组织损伤观察

3 讨论

通过对小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌MT820501的耐药性研究发现，该菌株对极少数β-内酰胺类药物、四环素类药物、喹诺酮类药物、多肽类药物及氨基糖苷类药物敏感，对大部分药物耐药。刘青等[14]在对107份圈养野生动物源大肠杆菌的耐药性研究中发现，杂食动物源大肠杆菌中有90%以上的菌株对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物敏感，70%以上的菌株对β-内酰胺类药物敏感。而本研究显示，同样作为杂食动物的小熊猫，体内分离的大肠杆菌对氨苄西林、羧苄西林、头孢哌酮、庆大霉素等出现一定的耐药性，与兽医在小熊猫死亡前使用舒普深和庆大霉素治疗无效的情况吻合。大肠杆菌耐药性的产生与抗生素种类、抗生素使用频率、使用剂量等密切相关。李州[8]对福州动物园内的动物源大肠杆菌耐药性研究显示，有48株表现为三重以上的耐药菌株，占比64.86%；东北虎林园内虎源大肠杆菌对常用抗生素氨苄西林耐药率达100%，对四环素、复方新诺明等药物也表现出高度的耐药性[15]。据文献报道，多种圈养野生动物如大熊猫[16]、东北虎(Pantheratigrisaltaica)[17]、鹤类[18]等出现产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌菌株。随着野生动物体内耐药菌株不断发现，给临床的疾病治疗及用药带来极大的挑战。因此，临床建议避免长期使用相同的抗生素或使用较为先进的抗生素，可通过药敏试验及时筛选敏感药物控制病情，同时长期监测动物体内常见菌的耐药性情况，合理使用抗生素，减少耐药性的产生。

本研究小鼠人工感染菌株后显示，该菌株对小鼠有一定的致病性，其半数致死量为8.42×107cfu/mL。从感染小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中，均分离到与前期从死亡小熊猫体内分离菌株一致的菌落。通过对死亡小鼠的病理组织学观察发现，其心脏、肝脏和肾脏内均能发现染成蓝色的细菌团块，多个实质脏器出现水肿、充血、细胞变性甚至坏死、炎性细胞浸润等现象。这些病变是细菌性败血症的典型特征[19]，与高新蕾等[20]在对小鼠感染致肾盂肾炎大肠杆菌的组织病理学表现一致，也与死亡小熊猫肾脏、肝脏和肺脏均出现充血、实质细胞变性坏死及中性粒细胞浸润等病理现象高度相似[21]。其中，肾脏皮质区和髓质区都观察到肾小管上皮细胞广泛性肿大及颗粒变性，部分肾小管上皮细胞甚至整个肾小管坏死，表明该菌株对肾脏的毒性较大，可能与该菌株的P菌毛、Ⅰ型菌毛占比较高密切相关，这2种毒力因子可介导菌株在肾脏的定植，增加其对肾脏的致病性[21-22]。

与之前死亡小熊猫病理表现不同的是，小鼠的各肠段均发生了肠绒毛上皮脱落，固有层毛细血管扩张，充满红细胞的病变。推测小鼠与小熊猫细菌感染出现病理表现差异的主要原因有3个：(1)二者属于不同种属，具有较大种属差异，不同动物的遗传特性和生物学特性不同，对大肠杆菌的清除率和易感性存在差异，感染时会有不同表现[23]。(2)实验小鼠的微生物、寄生虫等级情况明晰，且培养环境条件有一定的控制，和小熊猫的生活环境条件有较大差异，二者接触病原种类不同，免疫系统功能也不同，病原致病特性表现也会有所差异[24]。(3)小鼠细菌感染试验时采用腹腔注射细菌，更容易通过全身的血液循环导致多器官出现病理损伤，而致肾盂肾炎大肠杆菌为尿路感染的主要细菌，一旦上行至上尿道，临床的病理表现包括肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎[22]。死亡小熊猫的主要病理损伤表现为肾盂肾炎[21]，因此，小熊猫自然感染致肾盂肾炎大肠杆菌的可能路径为通过尿道上行感染而诱发机体出现炎症特征，不同感染途径也可能使得二者的病理表现出现差异。

4 结论

本研究通过对前期课题组分离的小熊猫源致肾盂肾炎大肠杆菌MT820501进行药敏试验及小鼠感染实验，证明该菌株对临床上常使用的氨苄西林、头孢哌酮、庆大霉素等药物产生一定的耐药性。动物感染实验显示该菌株有一定的致病性，建议临床上使用哌拉西林、头孢西丁、美罗培南等敏感药物进行此类细菌病的防治。另外，注意长期监测圈养动物体内常见菌的耐药性情况，避免长期使用相同抗生素、较新抗生素，以减少耐药性的产生。