响应面法优化凹纹胡蜂蜂房多糖提取工艺及抗氧化性研究

王振吉，杨申明，陈 靖，王欣怡

（楚雄师范学院 资源环境与化学学院，云南 楚雄 675000）

蜂房(Nidus Vespae)，又称露蜂房、紫金沙等，为胡蜂科昆虫果马蜂(Polistes olivaceousDeGeer)、日本长脚胡蜂(P. japonicusSaussure)或异腹胡蜂(P. variaFabricius)的巢［1-2］。蜂房药用历史悠久，在《神农本草经》中记载，具有消肿散结、攻毒杀虫之功效，临床上常用来治疗疮疡肿毒、牙痛、乳痈、瘰疬等病症［3］。蜂房的化学成分复杂，不仅有昆虫的共性成分，而且有植物源性成分，主要含有含黄酮、萜类、甾类等多种化学成分［4］。大量研究表明，蜂房在治疗肿瘤及多种炎症方面具有显著疗效，在医药领域中有广泛应用前景。

凹纹胡蜂(Vespa arariaSmith)又称葫芦蜂、白脚蜂等，属于胡蜂总科胡蜂属，主要分布于云南、四川等地［5］。该胡蜂可造大型巢，具有重要应用价值［6］。王振吉等［7］研究表明：从凹纹胡蜂蜂房提取的总黄酮有一定的抗氧化性；杨新周等［8］研究表明：用水浴回流法可同时提取凹纹胡蜂蜂巢中的黄酮、多酚、多糖等成分，且蜂巢不同部位均具有一定的抗氧化性。其他有关凹纹胡蜂蜂房的研究鲜见报道，大部分凹纹胡蜂蜂房没有得到有效利用，造成了蜂房资源的浪费。多糖(Polysaccharide)普遍存在于自然界动植物中［9］，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生理活性［10-12］。若能从凹纹胡蜂蜂房中提取多糖类物质，并用于医药领域中，对于凹纹胡蜂资源利用具有重要意义。

目前，有关VASNVP提取工艺及抗氧化性的研究鲜见报道。为此本研究采用凹纹胡蜂蜂房为试验材料，利用纤维素酶协同超声辅助提取VASNVP，通过单因素试验和响应面试验优化VASNVP提取工艺。同时，通过测定VASNVP对羟基自由基、DPPH自由基的清除能力和Fe3+的还原能力来评价其多糖抗氧化性，旨在为VASNVP在医药领域中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凹纹胡蜂蜂房，产自云南省广通镇，经鉴定为凹纹胡蜂的巢。葡萄糖标准品，HPLC≥98%，上海索莱宝科技有限公司；纤维素酶（酶活力50000 U/g），天津诺奥科技发展有限公司；DPPH自由基，上海蓝季科技发展有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5500型分光光度计，由上海元析仪器有限公司生产；SK8210HP 型超声波清洗器，由上海科导超声仪器有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 VASNVP提取工艺流程 凹纹胡蜂蜂房→晒干→粉碎→过筛（60目）→石油醚脱脂→烘干（55 ℃）→称量→纤维素酶协同超声波提取→减压抽滤→Sevag法脱蛋白→溶液定容至50 mL容量瓶→得到凹纹胡蜂蜂房多糖提取液。

1.3.2 多糖含量的测定 以葡萄糖为标准品，利用苯酚—浓硫酸法测定多糖含量［13］。由测定的吸光度和葡萄糖标准溶液质量浓度，得到标准曲线方程A=64.536C-0.0453，相关系数R2=0.9997。多糖含量的计算公式为：

式（1）中：C为供试品溶液中多糖质量浓度(mg/mL)；V为定容体积（mL）；N为稀释倍数；M为凹纹胡蜂蜂房干粉质量(g)。

1.3.3 单因素试验 探究超声功率分别为200、250、300、350、400 W下提取VASNVP，超声温度50℃，超声时间70 min，液料比(mL/g)50∶1，纤维素酶用量6.0%；确定了超声功率300 W提取效果较好后，探究超声温度分别为40、45、50、55、60 ℃下提取VASNVP，超声时间70 min，液料比(mL/g)50∶ 1，纤维素酶用量6.0%；确定了超声温度50 ℃提取效果较好后，探究超声时间分别为50、60、70、80、90 min下提取VASNVP，超声功率300 W，液料比(mL/g)50∶1，纤维素酶用量6.0%；确定了超声时间70 min提取效果较好后，探究液料比(mL/g)分别为30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1下 提 取VASNVP，超声功率300 W，超声温度50 ℃，纤维素酶用量6.0%；确定了料液比(mL/g)为50∶1提取效果较好后，探究纤维素酶用量分别为4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%下提取VASNVP，超声功率300 W，超声温度50 ℃，超声时间70 min，从而确定纤维素酶的最佳用量。

1.3.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，选取影响因素较大的超声温度(A)、超声时间(B)、液料比(C)、纤维素酶用量(D)为自变量，以VASNVP提取量为响应值，设计4因素3水平响应曲面试验，优化提取工艺条件（表1）。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.3.5 VASNVP抗氧化性测定 将VASNVP溶液配制成5种不同质量浓度（0.005082、0.010164、0.015246、0.020328、0.02541 mg/mL），测定其抗氧化性。

1.3.5.1 VASNVP对羟基自由基(·OH)的清除作用 参照Chen等［14］方法测定VASNVP对·OH的清除能力。以维生素C(VC)作阳性对照，按式（2）计算VASNVP对·OH的清除率：

1.3.5.2 VASNVP对DPPH自由基的清除作用 参照许世浩等［15］方法测定VASNVP对DPPH·的清除能力。以VC作阳性对照，按式（3）计算VASNVP对DPPH·的清除率：

1.3.5.3 VASNVP还原能力的测定 分别在5支试管中加1 mL不同质量浓度VASNVP，加1%铁氰化钾和0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值6.6）各2 mL，混匀，在50 ℃中恒温水浴20 min，加2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，离心，取2 mL上清液，加2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，反应10 min后，测定在700 nm波长处的吸光度，以VC作阳性对照［16］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

超声功率、超声温度、超声时间、液料比和纤维素酶用量对VASNVP提取量的影响结果如图1所示。

图1 不同提取条件对VASNVP提取量的影响

由图1a可知，当超声功率增大至300 W时，VASNVP提取量达到最大值，为5.79 mg/g。这可能是因为超声功率增加，增大了超声波机械搅拌作用，有利于多糖溶出；之后若再增大超声波功率，多糖提取量反而有减少的趋势。因此，适宜的超声功率在300 W左右。

由图1b可知，当超声温度升高至45 ℃时，VASNVP提取量达到最大值，为5.93 mg/g。这可能是随着超声温度升高，纤维素酶活力增大，但当超声温度超过纤维素酶最适宜温度后，酶失去活性，导致提取量下降。因此，适宜超声温度在45℃左右。

由图1c可知，当超声提取时间增加至70 min时，VASNVP提取量达到最大值，为5.86 mg/g。这可能是超声时间达到70 min时VASNVP能最大程度地溶出，之后随着超声时间增加，纤维素酶容易变质而失去活性，导致多糖提取率下降。因此，适宜超声时间在70 min左右。

由图1d可知，随着液料比增大，VASNVP提取量呈先增大后减少的变化趋势。这可能是因为溶剂用量增加，凹纹胡蜂蜂房与溶剂接触面增大，提取量增加。当液料比(mL/g)达到50∶1时，VAS-NVP提取量达到最大值，为5.82 mg/g。之后继续增大液料比，VASNVP提取量呈减小的趋势。因此，适宜的液料比(mL/g)为50∶1左右。

由图1e可知，当纤维素酶用量增加至6.0%时，VASNVP提取量达到最大值，为5.98 mg/g。之后VASNVP提取量随着酶用量增加而下降。这可能是酶用量低于最佳值时酶解不完全，达到最佳值时酶解完全；此时如果继续加大酶量，底物浓度不能使酶达到饱和，导致酶作用受到抑制［17］。因此，适宜纤维素酶用量为6.0%左右。

2.2 响应面法优化VASNVP工艺条件

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据中心组合试验设计原理，利用响应面试验优化提取工艺条件，试验设计及结果如表2。

表2 Box-Benhnken试验设计及结果

2.2.2 回归模型显著性检验及方差分析 对表2中的数据进行回归分析，得到VASNVP提取量对编码自变量的回归方程为：Y=6.00-0.018A-0.21B+0.10C-0.21D-0.13AB-0.060AC-0.21AD-0.15BC-0.094BD-0.10CD-0.33A2-0.34B2-0.17C2-0.39D2。说明所考察的4个因素对响应值的影响不是简单的线性关系。回归方程显著性检验及方差分析的结果见表3。

由表3可知，该模型P＜0.0001，说明此模型达到极显著。失拟项P=0.054＞0.05，表示拟合程度较高，试验误差小，可用于设计试验范围内的预测。超声时间(B)、液料比(C)、纤维素酶用量(D)、超声温度与超声时间的交互项(AB)、超声温度与纤维素酶用量的交互项(AD)、超声时间与液料比的交互项(BC)、液料比与纤维素酶用量的交互项(CD)、超声温度的二次(A2)、超声时间的二次项(B2)、液料比的二次项(C2)、纤维素酶用量的二次项(D2)等对VASNVP提取量的影响极显著（P＜0.01），超声时间与纤维素酶用量的交互项(BD)对VASNVP提取量的影响显著（P＜0.05），说明上述这些因素对VASNVP提取量影响大，改变这些因素的水平会对响应值产生极显著的影响。

由表3中F值大小可知，影响VASNVP提取量的主次顺序为纤维素酶用量＞超声时间＞液料比＞超声温度，其中，纤维素酶用量对VASNVP的影响程度最大。回归模型系数R2=0.9758，说明此模型能解释97.58%响应值的变化，且模型R2Adj=0.9515＞0.8，说明此回归方程拟合度和可信度均很高。因此，此模型可用于代替真实试验点对VASNVP提取和预测。

表3 回归模型显著性检验及方差分析

2.2.3 验证性试验 根据所得模型，应用Design-Expert 8.0.5 b软件分析，得到VASNVP最佳提取条件为超声温度51.01 ℃、超声时间65.95 min、液料比(mL/g)为55.56∶1、纤维素酶用量5.68%，VASNVP提取量预测值为6.10 mg/g。考虑到实际试验情况，提取条件修正为：超声温度51.0 ℃、超声时间66.0 min、液料比(mL/g)为56∶1、纤维素酶用量5.7%，在此条件下得到VASNVP提取量平均值为6.08 mg/g，理论值与实际值相对标准偏差为0.33%。

2.3 VASNVP抗氧化性分析

2.3.1 ·OH清除能力的测定 由图2可知，在VASNVP质量浓度为0.005082～0.02510 mg/mL范围内的时候，随着VASNVP质量浓度的增大，清除·OH的能力不断增强。当VASNVP质量浓度为0.02541 mg/mL时，对·OH的清除率为52.41%，与阳性对照VC的清除率（93.13%）相比较弱，但VASNVP也有一定的清除羟基自由基的能力。

图2 不同质量浓度VASNVP对羟基自由基的清除效果

2.3.2 DPPH·清除能力的测定 从图3可知，随着VASNVP浓度的增大，其清除DPPH·的能力也逐渐增强。在VASNVP质量浓度为0.00502～0.02510 mg/mL的范围内，DPPH·的清除率为最大52.41%，此时多糖质量浓度为0.02510 mg/mL，尽管VASNVP清除DPPH·的效果稍差于阳性对照VC的，但是VASNVP依然表现出清除DPPH·的能力较强，表明VASNVP具有较好的抗氧化能力。

图3 不同质量浓度VASNVP对DPPH自由基的清除效果

2.3.3 Fe3+还原能力的测定 由图4可知，在VASNVP质量浓度为0.00502～0.02510 mg/mL范围时，VASNVP的还原能力随浓度的增大而增强。当其质量浓度为0.02510 mg/mL时，使Fe3+还原产生的吸光度值为0.326，较阳性对照VC的还原能力（吸光度值为0.351）稍弱，这表明VASNVP对Fe3+具有很强的还原能力。

图4 不同质量浓度VASNVP对Fe3+的还原能力

3 结论

本文采用纤维素酶协同超声辅助提取VASNVP，通过响应面法优化了VASNVP提取工艺条件。优化得到VASNVP最佳工艺条件：超声温度51.0 ℃、超声时间66.0 min、液料比(mL/g)56∶1、纤维素酶用量5.7%，在此条件下VASNVP提取量平均值为6.08 mg/g，与预测值(6.10 mg/g)接近，预测值与实际值相对标准偏差为0.33%。说明运用响应面法进行分析的数据可靠，有一定的实用价值，并能用于生产实际。

抗氧化性试验结果表明，当VASNVP质量浓度在0.00502～0.02510 mg/g范围内时，随着VASNVP质量浓度的增加，其清除·OH 、DPPH·的能力和对Fe3+的还原能力增强，即VASNVP质量浓度与清除率和Fe3+还原能力有量效关系。VASNVP具有一定的抗氧化能力，可作为抗氧化剂资源进行开发利用。