芒果食叶象甲的生物学特性及其rDNA-ITS1序列特征分析

杨翠凤，滕 峥，欧阳秋飞，苏仕林

（百色学院 农业与食品工程学院，广西 百色 533000）

芒果象甲(SternochetusPierce)是芒果的重要害虫之一，属于鞘翅目(Coleoptera)象虫科(Curcµ-Lionidae)隐喙象亚科(Cryptorhynchinae)洞腹象属(Sternochetus)［1］，为害种类多且难以消除，为害果核的有芒果果核象甲(S. mangiferaeFabricius)、芒果果实象甲(S. olivieriFaust)，为害果肉的有芒果果肉象甲(S. frigidusFabricius)，而为害叶片和嫩梢的有芒果切叶象甲(Deporaus marginatusPascoe)及其他食叶象甲。芒果象甲在国外主要分布在亚洲的印度、巴基斯坦、越南等芒果的重要产区，国内主要分布于广西、广东、海南、福建、江西及台湾省等部分芒果种植地［2］。芒果树一旦受到象甲虫的为害，若不及时防治，便会直接带来芒果产量和经济的损失。因此，尽早发现和识别芒果象甲是有效防治的关键。本课题组前期对百色地区具有代表性的芒果种植园进行芒果象甲种类和为害调查，调查结果表明芒果食叶象甲的为害率和虫情指数最高，主要发生在抽梢期和开花期，以嫩梢和叶片为食，导致嫩梢及嫩叶卷曲、残缺不全，有的枝梢甚至发生枯萎、萎蔫的现象［3-4］。rDNA-ITS基因片段是现在公认的DNA条形码有效候选片段之一，广泛应用于动植物的鉴定系统发育的探讨和亲缘关系的研究［5-7］。前人已利用rDNA-ITS序列开展了吸血蠓［8］、苹果异胫小卷蛾［9］、香蕉穿孔线虫［10］等的分子鉴定，利用rDNA-ITS序列分析法鉴定了桑椹菌核病病原菌［11］，利用rDNA-ITS1或ITS2基因对石斑鱼［12］、飞虱［13］、米尔顿姬小蜂［14］序列及其分子系统进化进行了分析等。rDNA-ITS序列的应用克服了传统形态学识别的不足，为昆虫领域分子生物学的研究奠定了基础。本研究拟在前期调查分析基础上，进一步开展了芒果食叶象甲生物学特征的观测及rDNA-ITS1序列克隆和亲缘关系的分析，以期为今后开展芒果象甲的分子鉴定、种群遗传多样性及防治等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在实地调查的基础上，采集芒果食叶象甲成虫，对其中的13头芒果食叶象甲成虫进行rDNAITS1序列扩增与分析，编号为1-1～1-13；试验药品主要为DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PCR引物、DNA Tap酶等；试验仪器主要有捕虫器、展翅板、昆虫针、镊子、养虫盒(25 cm×10 cm)、放大镜、体视显微镜、水浴锅、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 芒果食叶象甲的种类与为害调查 使用随机定点调查的方式，于2018年3月—2019年6月对百色市右江区六苜村、田阳区峒芒村、田东县六联村的芒果种植园进行调查，每个园区随机选择30株芒果树，分别选取东、南、西、北、中5个方位调查点的2～3根枝条作为固定调查对象。结合芒果物候期，如抽梢期、花期、坐果期等进行调查，统计分析芒果食叶象甲在百色地区的发生情况与为害程度，为害严重程度用重(+++)、中(++)、轻(+)表示。

1.2.2 芒果食叶性象甲生物学特性观察 分别在田间调查与实验室饲养环境下，观察和记录芒果食叶性象甲的生物学特征，包括形态特征、生活史和生活习性等。

1.2.3 基因组总DNA提取 采用小批量DNA提取试剂盒（由上海碧云天生物科技有限公司生产）提取象甲虫基因组的总DNA，1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.4 rDNA-ITS1序列扩增 引物为通用引物，ITS1F：5′-TAT AGC ATT CCC CGT TTA-3′，ITS1R：5′-TCC TAA TAA ACC AAT TGC-3′，由深圳华大基因科技有限公司合成。PCR反应体系为50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL，DNA模板4 μL、ddH2O 17 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；最后，72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物回收纯化后连接至pMD18-T连接载体，转入E. coilDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至深圳华大基因测序部测序。

1.2.5 序列分析 采用DNAStar软件的MegAlign对序列进行比对分析，比对后的序列在View中Sequence Distance进行遗传分歧及遗传相似性计算，运用Editseq软件进行碱基含量分析。利用MEGA 5.05软件中Phylogeny工具进行序列组成分析，运用NJ法(Neighbor-Joining Tree)自展1000次建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 芒果食叶象甲的种类与为害程度

经调查，在六苜村、峒芒村和六联村的芒果种植基地共发现4种食叶象甲，为害程度最高的是芒果切叶象甲(Deporaus marginatusPascoe)，其次是芒果蓝卷叶象(Involvulussp.)和绿鳞象甲(Hypomences squamosusFabricius)，为害程度相对较低的是小绿象甲(Platymycteropsis mandarinusFaimaire)(表1)［3］。其中，芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象主要为害芒果新长出的嫩梢和嫩叶；绿鳞象甲、小绿象甲通过咬食叶片，使芒果叶片残缺不全，影响芒果树的生长。

表1 芒果食叶象甲种类与为害程度

2.2 芒果食叶象甲的生物学特性

本次调查结果表明，百色芒果种植基地以芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象、绿鳞象甲3种食叶性象甲的为害程度较高，因而进一步观察和记录芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象和绿鳞象甲的生物学特性，以期为百色地区芒果象甲为害的监测、防治提供一定的参考。

2.2.1 芒果切叶象甲的生物学特性 芒果切叶象甲，又称为切叶象甲、切叶虎等，其分布范围较广，在海南、云南、广西、广东及台湾省等芒果种植地区均有发生，是华南地区为害芒果树嫩梢的重要害虫之一。成虫咬食芒果树嫩梢叶的上表皮而留下嫩叶的下表皮，使叶片卷缩、干枯、萎蔫，雌成虫在嫩叶上产卵后，在近叶片的基部将其横向咬断，使带卵部分落到地面上，叶片基部留下类似剪刀剪过的痕迹。幼虫孵化后潜藏在嫩叶肉内，被害处可见蜿蜒曲折潜食过的隧道痕迹，然后逐渐扩张形成大大小小的成片斑块，最后仅剩两面表皮，从而影响了芒果树的光合作用和生长发育。

形态特征：体长约6 mm，褐色，身体表面有白色绒毛，触角、复眼以及喙均为黑色。鞘翅褐色，每个翅上有10行，肩角圆钝，足腿为褐色。卵为长椭圆形，随着生长发育过程的推进，卵的颜色由乳白色向逐渐转变为淡黄色，且表面光滑。幼虫为无足型，初孵化时为乳白色，然后逐渐变成淡黄色，腹部的各节之间两侧各有1对小肉刺。蛹为裸蛹，淡黄色，随着发育过程的推进而逐渐向茶褐色过渡，头部开始出现乳状突起，末节有肉刺1对。

生活史：芒果切叶象甲在百色地区1年内发生4代，第1代成虫在5月末，第2代成虫在7月中旬，第3代成虫在8月下旬，第4代成虫在9月中旬。成虫的寿命比较长，世代可以重叠在一起生长，夏、秋季每代长达30 d左右，冬季处于静伏期。以幼虫在土壤越冬，次年3月中旬至4月初羽化成为成虫，成虫出土后飞向地面为害芒果嫩梢、啃食嫩叶，3～5 d后开始交尾，交尾后1～2 d内开始产卵，成虫产卵量250粒/头左右，卵期4～6 d。卵产于芒果嫩叶正面主脉组织中。产卵后，成虫横向咬食叶肉，像剪刀一样将叶面平整切断，使其所产的卵随叶片落到地面上；4月中旬，幼虫孵出后由主脉向两侧潜食叶肉，幼虫期6 d左右，老熟后入土化蛹。蛹室深度2～3 cm，蛹期20～30 d，芒果切叶象甲每年自5月起世代重叠。芒果切叶象甲在百色地区1年有2个为害高峰期：5月下旬至6月，芒果抽梢盛期受害最严重；8月上旬至9月中下旬，正值芒果秋梢期，受害也比较严重。

生活习性：群集取食，主要取食芒果嫩叶，聚集一起的成虫共同啃食叶片，直至叶片脱落；成虫具有假死性，受震动或被触时，立即收拢足和触角，坠地假死。求偶交尾：雄虫在求偶交尾过程中占主导地位，围绕在雌虫周围，用触角试探，等雌虫进食完毕，爬到雌虫背部进行交尾，交尾通常发生在晴天的上午，每次交尾时间约2 min。产卵切叶：雌虫选择新鲜的嫩叶片，从叶片中脉基部向叶边缘开始咬切，当半边叶片完全切开后，在合适的部位开始产卵，每产1枚卵随即对产卵孔用喙来回抚平。幼虫有避光性，孵化1周后则进入土中，构造蛹室，化成蛹。

2.2.2 芒果蓝卷叶象的生物学特性 芒果蓝卷叶象，亦称蓝色象鼻虫，该虫分布范围广，各芒果种植区均发现该虫的为害。成虫主要利用其长象鼻吸食芒果嫩梢汁液，造成芒果嫩梢干枯萎蔫甚至整个植株枯萎死亡，为害较严重。

形态特征：成虫长、宽分别约为6、3 mm。身体蓝黑色有光泽，表面有绒毛，头部深棕色，有细恒皱纹，喙较长，两端宽中间窄，后背处有两浅纵凹沟，触角棒节大且扁，肩角圆钝，翅坡处宽，各足无齿。幼虫、蛹均为黄白色。

生活史：在百色地区1年发生2代，在植物附近的枯树枝下、砖石或土缝中越冬，越冬成虫于3月初出土，成虫于芒果抽梢季节的3—6月进入盛发期，4月初至9月底产卵，卵期1周左右，于4月下旬开始幼虫孵化，约为30 d，5月中旬开始化蛹，蛹期历时15～30 d，6月初羽化的成虫开始出土活动，10月下旬羽化的成虫在土壤中潜伏越冬。

生活习性：成虫具有假死性及群集性取食，主要为害芒果的嫩枝梢，用其象鼻食吸食芒果嫩梢的汁液，聚集一起的成虫共同吸食嫩梢，直到嫩梢干枯萎蔫。成虫为害芒果嫩梢时，先用象鼻挖一个孔洞，孔洞绕枝干呈螺旋形或呈圆周形整齐而紧密地排列，在嫩梢上形成一圈环状的孔洞，为害严重时，一条嫩枝梢上有3～4圈整齐排列的孔洞。孔洞形成后，成虫便选择其中的孔洞产卵。芒果嫩枝的皮层被扎孔后，上部叶片便失水萎垂，直至整个嫩梢干枯。

2.2.3 绿鳞象甲的生物学特性 绿鳞象甲，别名蓝绿象、绿绒象虫、大绿象虫等，是为害我国农林业经济作物的重要害虫之一，该虫为害的作物类别较多，以成虫取食作物嫩叶、嫩芽及嫩梢为主，常造成叶片及枝条残缺不全或叶片留下大大小小的孔洞，为害严重时还会造成大量的落花、落果。在百色地区，该虫除了为害芒果外，还为害油茶、柑橘、甘蔗、桑树等农林经济作物，严重影响了当地农林经济作物的健康发展。

形态特征：成虫长约16 mm，身体大多呈绿色，表面覆盖一层闪光的绿色鳞毛，少数是黄色及灰色。喙扁平，中间有宽而深的中缝，复眼较突出，背部中央有纵沟，小盾片呈三角形，与雄虫相比较，雌虫腹部较大。卵呈椭圆形，体长1 mm左右，黄白色，接近孵化前逐渐变为黑色。幼虫随着发育过程的推进，体色逐渐由乳白色转变为黄白色，体长15～17 mm。体表多皱，无足。蛹为黄白色，长13～15 mm。

生活史：在百色地区1年发生2代。4—6月成虫盛发，越冬成虫于3月中旬爬出地面活动，5月中旬至下旬进入盛发活跃期，8月中旬成虫开始减少活动，4月下旬至10月中旬为产卵期，每只雌虫能产80枚卵，5月上旬至10月中旬为幼虫孵化期，幼虫活动期历时3个月左右，9月中旬、10月中旬幼虫老熟后在土壤中化蛹，蛹期为15～20 d，9月下旬羽化的成虫只有极个别出来活动，10月羽化的成虫在土壤中潜伏越冬。

生活习性：成虫白天较活跃，晚上活跃性不强，成虫爬行能力较强，飞行能力较弱，具有聚集性和假死性，出土后爬至枝梢啃食为害嫩叶，取食活跃，造成芒果树枝梢叶片残缺不全，进而影响了芒果树的正常生长发育。雌雄成虫交配频繁，每次交配时间为5～6 h，将卵产于叶片上，幼虫孵化后进入土壤中取食杂草及树根，靠近杂草多的芒果园往往受害较严重。

2.3 芒果食叶象甲的rDNA-ITS1序列分析

13头芒果食叶象甲的rDNA-ITS1序列长度在988～1240 bp之间，具体的碱基组成特征见表1，其中A+T含量(638～862 bp)为64.37%～74.89%，明显高于C+G含量(252～389 bp)的25.11%～35.56%，碱基组成表现出明显的A+T偏好性特点，而且碱基的转换以颠换为主。

表2 芒果食叶象甲的rDNA-ITS1序列特征

2.4 rDNA-ITS1序列的同源性分析

采用DNAStar软件的MegAlign程序中Alignment Report对所得到的芒果食叶象甲rDNA-ITS1序列进行同源性比较。结果表明：芒果象甲种群之间存在一定程度的遗传分歧和相似性，其中，遗传分歧最大的是象甲1-6与1-7、1-3与1-6，序列相似性均仅为37.0%，而遗传相似性最高的为象甲1-8与1-9，相似性为100.0%(表3)。

表3 芒果象甲rDNA-ITS1序列的相似性

2.5 象甲虫之间的亲缘关系分析

NJ进化树将13头芒果食叶象甲分为2大类群(图1)，象甲1-4与1-6的亲缘关系较近，与其他象甲的亲缘关系较远，聚为1个分支，其余12头象甲具有较高的相似性，组成另1个分支，其中象甲1-2单独为1个亚类群，其余10头象甲聚为另1个亚类群。

图1 基于rDNA-ITS1序列的NJ系统发育树

3 讨论

3.1 芒果食叶象甲的种类与为害程度

经调查，百色地区为害指数较高的芒果食叶象甲依次是芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象、绿鳞象甲，这3种象甲通过为害嫩梢、嫩叶等，导致芒果的产量和品质下降，严重影响了芒果果实的产量和品质。通过观察芒果食叶象甲成虫的形态学及其产卵、孵化、幼虫、成虫发育的生活史等生物学特性，初步掌握了百色地区芒果食叶象甲种类、为害分布及其生活习性。本研究结果可为百色地区的芒果象甲为害的监测、防治提供一定的借鉴，为促进百色地区芒果质量和产量的提高，推动芒果产业经济的可持续发展提供一定的参考。

3.2 rDNA-ITS1基因序列同源性及碱基含量比较

目前，国内对芒果象甲的鉴别主要是通过形态学方法来完成，然而形态学观察耗时长，而且由于幼虫时期或者成虫标本不完整，给鉴定工作带来了诸多不便。因此，单纯依靠传统的形态学鉴定难以快速获得准确的结果，而分子鉴定技术能很好地解决这一难题。rDNA是生物体内最保守的基因之一，其内转录间隔区(ITS)具有极大的种间甚至种内的变异性，被认为是发展敏感、特异检测系统的理想靶物［7,15-17］。本研究克隆获得了13头芒果食叶象甲的rDNA-ITS1基因序列，通过分析序列碱基组成及同源性表明，rDNA-ITS1基因序列的碱基组成表现出明显的A+T偏好性特点，遗传距离表明芒果象甲之间存在一定程度的遗传分化，证实rDNA-ITS1基因序列能较好地反映出芒果食叶象甲之间的差异性和相似性。

3.3 基于rDNA-ITS1基因序列的系统发育树分析

基于rDNA-ITS1基因序列探讨了13头芒果食叶象甲之间的亲缘关系，从NJ进化树可以看出，rDNA-ITS1基因序列可以将13头芒果食叶象甲分为2大类群：象甲1-4与1-6的亲缘关系较近，而与其他象甲的亲缘关系较远，聚为1个类群；象甲1-2单独为1个亚类群；其余10头象甲的亲缘关系较近聚为另1个亚类群。聚类分析结果与基于mtDNA-COI序列的研究结果一致［18］。本研究结果反映了种群间遗传关系既具有一定的相似性，又存在一定的遗传分化。由此证明了今后可以将rDNA-ITS1基因序列用于芒果象甲虫种群遗传多样性分析以及分子鉴定等。

4 结论

经笔者的调查显示，百色地区为害指数较高的芒果食叶象甲依次是芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象、绿鳞象甲，这3种象甲的存在严重影响了芒果的产量和品质。通过进一步观察芒果食叶象甲的生物学特性，初步掌握了芒果切叶象甲、芒果蓝卷叶象和绿鳞象甲的为害分布特征及其生活习性，为百色地区的芒果象甲为害的监测、防治提供一定的借鉴。通过克隆获得了13头芒果食叶性象甲的rDNA-ITS1基因序列，结果表明：rDNA-ITS1序列碱基含量表现出明显的A+T偏好性特点；13头芒果象甲虫之间存在一定的遗传分化，NJ发育树将其分为2大类群，其中，象甲1-4、1-6与其他象甲的亲缘关系较远，聚为1个分支，其余12头象甲具有较高的相似性，组成另1个分支，本研究结果与基于mtDNA-COI序列的研究结果高度一致。由此表明，rDNA-ITS1基因序列在一定程度上能够反映出芒果象甲之间的遗传分化和相似性，可为今后开展芒果象甲的分子鉴定、种群亲缘关系及防治等研究奠定基础。