食品微生物检验方法和技术研究进展

刘英语，程爱迪，吴酉芝，彭 飞

（1.上海中侨职业技术大学 食品药品学院，上海 201514；2.南昌大学 食品学院，江西 南昌 330047；3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

0 引言

食品微生物检验是目前国内外检验食品安全性的权威手段。这些年来频发的食品安全事故，不断降低人们对市场上食品安全的信心，其中微生物污染是食品安全中最为突出的问题[1]。判定食品中的微生物是否合乎检验标准是衡量食品安全度的一个关键方法，这也是评估被检品能否流入市场并且安全食用的科学依据[2]。保证食品安全可以有效减少人畜中毒等事件，提升食品的价值性和保证人体健康。所以，发展微生物筛选技术是食品工业健康发展的关键。原料生产制造环境、食物种类与包装材料和微生物类型与含量等因素对食物生产都有影响，可能引起食品变质，那么从原料到成品及食品保藏等阶段都应严格监控，因此国内外学者应该更努力以切实有效且科学的手段保障食品安全[3-6]。

1 食品微生物检验技术现状

长期以来，食品微生物检验技术一直采用标准的分离纯化、制剂、生化和血清分析步骤。传统方法具有准确可靠的优点，但存在检查程序时间长、所需人员专业化水平高、检查程序多、效率低等缺点[7-8]。例如，分离纯化和生化鉴定等步骤通常需要培养24 h以上的菌落，菌落挑选则需要具有一定专业经验的操作人员；另外，涉及目标细菌的鉴定等多种生化研究。我国在2003年以前颁布的国内食品检验标准几乎都是使用上述常规检验程序，直到2008年后国内标准出台，才逐渐更新检测技术和方法。在参考和创新检测标准的基础上，通过对受试样品进行了全面的质量监测，并根据近年来的监测数据和可行性管理提出了一些新的筛查和PCR检测方法，循环检测技术也被报道用于稳态温度测量和基因分析方法[9]。

2 食品微生物检测的定义及内容

2.1 食品微生物检测的定义

微生物检测技术主要是基于分离培养技术和利用教育知识来鉴定微生物种类。通常分为2个步骤：第一步是在微生物生长时测试样品，第二步是通过直接控制微生物性能进行生物鉴定。传统的微生物诊断方法主要包括2类：指示菌培养法和生理生化反应[10]。区别在于，前者要求该指示菌不能致病，并且可以快速生长，如大肠杆菌总数和肠杆菌数的测定；后者是要求标准菌株具有不同的性能症状，如能够产生酸、碱物质的代谢物，以及在一定温度和环境下的代谢作用[11]。

通过分离培养鉴定致病菌仍然是微生物检测的一种常用方法，但也存在明显的缺陷：分离培养的过程持续时间长、频率高、低效率和致病培养过程。由于细菌污染防不胜防，假如人类突然出现因致病菌污染而导致的食物中毒，传统检测技术因耗时偏长不能及时为急救医生等提供参考信息[12]。因此，微生物筛选技术的全面系统性建立及迅速程序化对医学临床工作和公共卫生事件具有重要的贡献意义。

2.2 食品微生物检测的内容

食品微生物检测的内容，通常分为食物总菌落密度、大肠菌群、致病菌3个部分来进行研究。菌落总数是对需要测试的食物进行适当处理后于固体培养基上每一平方单位表面积上所生长形成的菌落总数，以该项数据来反映该状态下相关食品中微生物的性质和数量[13-14]。而食品内部大肠菌群的检测，就是将该样品放置于适合大肠菌群生活的环境中，等待适当的时间，测算最终的相应数据，确定被检测食品中大肠菌群的数量[15]。检测人员在进行对病原菌测试后得出结论：食品中的大肠菌群数量超过正常水平，反映出食物中致病菌的存在几率增加，会威胁食用者的健康，甚至损害食用者的健康[16]。因此，食品中微生物的系统性检验是实现国内外食品安全目标的关键所在，也是食品行业自我升华的决定性因素[17]。

2.2.1 对食品污染程度指示菌的检验

细菌总数是指在一定条件下采集和培养的1 mL或1 g食品和饮用水中的细菌数量，也叫菌落总数，直接反映出食品的卫生质量[18]。大肠菌群可作为评估食品污染程度的指示菌；它们是指一组需氧或兼性厌氧的细菌，在36±1℃下培养能发酵乳糖产生酸和气体的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来自人和动物肠道[19]。而在评估食物和饮用水纯度的过程中检测到大肠菌群，即认为已被粪便污染。因此，大肠菌群的存在和数量高低不仅可以判断食品是否被粪便污染，而且也用来指示食品中肠道致病菌的存在几率。

2.2.2 对食品中致病菌的检测

GB 4789食品微生物学检验标准不断对微生物数量的统计、菌落形态描述、产毒菌种等方面做出更新。因此，不仅要重视食品中的大肠菌群（MPN）和菌落总数的检测；还需拓宽微生物种类检测领域，主要包括志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、产毒霉菌等致病菌，做到鉴定技术成熟化、检测程序规范化[20]。

3 食品微生物检测的技术分类

由于细菌具有生长周期短、繁殖快的特点，在食品微生物检验时，如果给予的培养基所含营养组分是完全正确且足够的，培养的细菌则会呈线性增长。如果继续培养大量细菌，细菌代谢产物就会出现，这些代谢产物的产生会改变细菌培养环境[21]。代谢技术通俗来讲是由电阻、辐射测量及代谢检测技术组成的技术模型，该技术的依据可能是监测微生物生长代谢物引起的分布阻力的变化[22]。目前，该研究可以用来检测食品中大肠杆菌的存在和数量，以及获取其他数据。上述诊断方法可以有效地测定相关细菌的数量和种类，了解食品中微生物的分布和含量，做到整体控制和分步控制。该类诊断方法在实测中得到了广泛的应用，这为今后的食品微生物检测分析研究注入了信心[23]。

3.1 抗体技术

根据相关文献研究的报道，可以得知抗体技术是将免疫检测技术应用于食品微生物检测过程的一种综合方法，这项技术的应用原理是根据抗原和抗体的特异性结合进一步分析探究抗原的数量与性质[24]。目前，应用相对广泛的抗体技术细分为：一是酶联免疫吸附法，该项技术联合生物酶催化反应效率高、专一性强和抗原抗体特异性结合的优势，在定性和定量检测样品中的特异微生物中得到了广泛的应用。二是乳胶凝聚反应，是指依照吸附在乳胶表面的抗原和样品中的抗体结合后产生凝集的检测技术，通过高度灵敏的反应可以实现对食品中金黄色葡萄球菌的检测。

3.2 分子生物学技术

生物技术包括2种通用技术，即聚合酶链反应技术和基因探针技术。其中，包括对食品中微生物迹象进行深度检测的基因工程，以及与性别有关的迹象的测序及其与微生物的有效结合，还有微生物的遗传学研究，以及各种微生物迹象和症状的鉴定[25]。目前的食品检测过程正在对分子生物技术进行深入的研究，分子生物学的检测方法有2种：一是聚合酶链反应技术，简称PCR技术，是以DNA分子作为模型进行缩放，并使用一对分别与模板互补的寡核苷酸片段作为基础模型的补充。在DNA聚合酶的作用下，沿着模板线延伸，直至形成新的DNA链；二是核酸探针检测技术，根据被标记的核酸序列与目的基因杂交的规则，可快速检测食品中的病原微生物[26]。

3.3 仪器技术

目前，鉴于食品种类的复杂化和检测标准的提高（如痕检），在实际测试过程中，相应的仪器技术也将由简单设备跨向复杂精密型检测设备，如光谱类、色谱类、致病菌微生物检测仪或多种设备联用[27]。食品检测仪器设备在食品检测中的应用分析。该类分析方法具有更高的精密度可以保证分析结果的准确性，还可以节约人力物力，以降低研究成本。仪器设备是保证食品检测顺利进行的先决条件，有利于保障食品微生物检测方法的严格化、全面化发展，这将是未来发展的方向。但在仪器设备研发创新和实际应用的整个过程中仍有很多研究需要学者的讨论和进一步的深化[28]。

3.4 快速检测技术

快速检测是指在较短的检测时间内，利用较为简便的仪器设备即可反馈准确可靠的测试结果的行为[29]。食品快速检测相关标准法规研究进展包括样品制备过程，通常认为可以在2 h内完成分析的化学和物理分析方法是一种快速检测方法[30]。与传统的标准方法相比，当前食品微生物测试方法的分析周期可以减少1/2或1/3，可以认为是一种快速反应方法，而快速现场测试通常会在30 min内得出测试结果。

4 食品微生物检验技术的发展趋势

随着医学技术和卫生事业的发展，食品微生物检验技术在科技的推动下迅速衍化。食品微生物检验技术正在从传统培养阶段向分子阶段转变，即食品微生物检验技术越来越科技化。高精尖的组合技术将是微生物检测机构最具发展力的技术，这也是对检验结果准确性和科学性的保障[31]。

同时，未来检验技术发展必将集中于监测设备的工具化和自主性，以及检验结果的准确性和时效性。另外，无论是从提高检验有效性和节约成本的角度考虑，还是从检验结果的准确性分析，人工试验和推导占据主体地位的检测必然会被自动化的仪器设备检测所取代；对测试结果的准确性和有效性的追求是所有技术的终点，同时技术发展和工具的自主性无非是为了达到更准确有效的测试结果的目的[32]。

4.1 基于传统微生物检测技术上的改进

对培养基成分进行改良，提高其特异性富集或改善分离效果，如沙门氏菌的胶体金快速检测试剂条等；对培养基的使用进行便利性的改进，集成的生化识别试剂条和仪器自动化技术等试剂的研发使检测便利性得到提高，还能将传统检验中比较繁琐的试验操作通过仪器实现自动化完成[33]。

4.2 免疫学快速筛选方法

由于免疫学反应具有快速，灵敏和特异的特点，因此可以用于目标生物的快速筛选，如快速检测试纸条[34-35]。该类方法在实测中不仅操作简便快速而且检测灵敏度更高，适合现场快速检测。免疫磁场的处理通过免疫来对目标微生物的集中以增加标准方法的灵敏度，并且还能筛选进行与自身酶有关的荧光扫描，完成自身免疫装置的扫描并达到自动生成的目的[36-38]。

4.3 基于核酸扩增的分子诊测技术

近年来，随着分子生物技术的发展，基于核酸分析的微生物检测技术和方法也不断吐故纳新，最常用的方法是荧光PCR和定量PCR，此外还有环介导恒温扩增法和依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）法[39-40]。这类方法首先需要确定目标生物保留的核酸序列，设计特定的碱基排列并访问核细胞数据系统，然后通过成像系统的核酸快速激活，使得核酸数量迅速增加，从而可以检测到片段，优点是可以在短时间内增加核酸片段的数量，从而可以扫描目标生物，此后在PCR技术的基础上发展多重PCR技术，即为多个目标微生物的核酸序列设计几个引物，然后同时破坏多种目标生物的核酸，最终结果可以通过琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、基因芯片杂交等技术进行食品微生物分析[41-42]。

5 结语

保证准确可靠的检测结果和规定准确有效的检测方法对食品进行微生物鉴定分析，能够为食品的安全性和完整性提供技术支持。虽然，我国目前的微生物检测技术比较先进，取得了良好的实验室效果，但时效和技术进步必然要回归到更有利的检测方法上。这意味着需要继续对食品微生物检测技术进行探究，以确保食品安全性隐患能够及时察觉并得到有效解决。

总之，人类健康与食物供应有着直接而深远的联系。希望能够提供严谨可靠的食品安全指标，以确保所有食品检测的科学相关性。近年来，国内外相关人员越来越意识到微生物食品需要准确跟踪相应的检测方法和检测规则的重要性，因此检验员必须严格遵守专业标准，不断学习、不断开发和完善检测技术。