全真一气汤通过ACTA2调节COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞收缩功能

蔡志胜，王春娥，陈可强

(1.福建中医药大学，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)作为目前全球第四大疾病死因的呼吸系统疾病，以持续性的呼吸道症状和气流受限为特征[1]。若治疗不当或延误治疗，将产生众多并发症，其中慢性肺源性心脏病便是COPD最常见的并发症之一[2]。肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)收缩导致的低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)被认为是慢性肺源性心脏病发病的前提及核心环节[3]，但是肺动脉平滑肌收缩的机制尚未完全明确。平滑肌是一种特殊的肌肉类型，具有控制或调节收缩和松弛的能力，覆盖呼吸系统中从气管到肺组织的大部分区域。先前的研究发现全真一气汤可以通过调节ACTA1改善COPD大鼠呼吸肌无力的症状[4]，促进呼吸肌的收缩。ACTA2是ACTA1的特异性同工型蛋白，由ACTA2基因编码的平滑肌肌动蛋白α被认为对血管平滑肌细胞的收缩功能起关键作用[5-6]。在中医学研究中，结合COPD的临床症状，现代中医医家认为COPD发生发展的内在因素主要与肺脾肾三脏功能失调密切相关，发病初期主要表现为肺气虚，后期累及肾脏。在临床实践中发现[7-9]，对COPD肾不纳气证患者进行西医治疗配合内服全真一气汤中药汤剂能够显著改善症状，延缓肺动脉高压的发生，提高患者生活质量，但作用机制尚不明确。为进一步探索全真一气汤的多靶点机制，研究使用全真一气汤干预COPD大鼠，通过检测大鼠肺组织中ACTA2基因及蛋白水平，探讨全真一气汤对肺动脉平滑肌收缩功能的调节作用。

1 主要材料与试剂

1.1 动物

SD大鼠18只，体质量180～220 g，清洁级。采购于广东省医学实验动物中心(NO：70092411)。于福建中医药研究院动物实验中心鼠类实验室进行本研究医学实验，清洁级。动物使用符合福建省医学实验动物管理委员会管理条例。

1.2 药物

根据明末清初医家冯楚瞻[10]所著《冯氏锦囊秘录》中的名方全真一气汤将生药制成40%的浓缩汤剂(组方：生晒参15 g，麦门冬15 g，熟地黄15 g，黑顺片6 g，炒白术6 g，川牛膝15 g，五味子6 g)。中药制法：①称量药材226 g，经蒸馏水浸30 min后煮沸，煮沸后再煎30 min，注意均匀搅拌，再经3层纱布过滤，取滤液；②得滤渣，加入蒸馏水再次将其煮沸后续煎20 min，再经3层纱布过滤，取滤液；③将所得的2次滤液充分混匀后，将其浓缩成含原材料1.0 g/mL的水煎液226 mL。药液常温冷却后，放至4 ℃冰箱内保存备用。原药材采购于福建省药材公司，浓缩中药汤剂由福建省第二人民医院制剂中心制作。

1.3 试剂与仪器

兔抗大鼠ACTA2抗体(美国Santa Craz公司)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，编号：D379212)；ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司，编号：DRR037A)；SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa公司，编号：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，编号：D9108A)；7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Westen-blotting(美国BIO-RAD)。

2 方法

2.1 分组

采用随机数字表法将18只清洁级健康雄性大鼠随机分为中药组与模型组，每组各9只。

2.2 动物模型建立

采用10%水合三氯乙醛于实验第1天、第11天、第21天经腹腔注射麻醉两组大鼠，取仰卧位，固定四肢及头部，行手术切开气管，经气管注入内毒素脂多糖200 μL(1 mg/mL)。旋转固定板，尽可能地使内毒素脂多糖充分均匀地分布于大鼠双肺。自制有机玻璃熏箱，熏箱的大小规格为30 cm×40 cm×50 cm。第2天起将所有大鼠置于该熏箱内进行COPD造模，箱内烟熏浓度设置为5%。除气管内滴注日不对大鼠进行烟熏外，每天均保持烟熏30 min，持续烟熏60 d。造模期间观察小鼠的一般情况。

2.3 给药方法

自第2天起，于每日上午8-9点，在熏烟前对中药组大鼠给予药物灌胃干预。灌胃前称量大鼠体质量，按照0.4 mL/20 g的药物剂量每日灌胃1次。模型组大鼠每日予0.9%生理盐水5 mL灌胃1次。灌胃给药前利用水浴法升高浓缩汤剂温度至与大鼠正常体温38 ℃接近，连续灌服60 d。

2.4 样本取材

经过60 d持续烟熏完毕，采取随机取样原则，每组随机选择3只大鼠样本，将样本大鼠颈椎脱臼处死后，浸入75%浓度的乙醇溶液中，5 min后将转移样本大鼠到超净工作台，随后样本大鼠仰面固定于解剖台上，用75%乙醇消毒胸部后，沿胸部正中线剪开皮肤，充分暴露样本大鼠胸腔，取右肺组织后利用消毒完毕的锡箔纸包裹标本并放入液氮中速冻，再转至-80 ℃冰箱中保存，以便用于实时荧光定量PCR及Western blot检测。

2.5 观察指标与测定方法

2.5.1 一般状况 每日观察两组大鼠的毛发光泽、呼吸情况、精神状态、饮食及摄水量状况及重量改变情况等。

2.5.2 实时荧光定量PCR检测 取大鼠右肺组织标本100 mg于研钵中加液氮快速研磨，总RNA采用TRIzol(invitrogen)法抽提取，总RNA提取后加入DNA酶对基因组进行消化，用ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒逆转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒以7500 Software v 2.0.5进行荧光扩增。使用SYBR Green I嵌合荧光法，Genebank序列(宝生物工程(大连)有限公司)检测基因的上下游引物序列，见表1。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃延伸1 min，40个循环，GAPDH作为内参照。以模型组mRNA的表达量为“1”，再依据校正值计算中药组mRNA的含量，并比较各组间表达量。所有步骤均严格按照试剂盒操作流程进行。

表1 检测基因的引物序列和产物长度

2.5.3 Western blot检测ACTA2蛋白水平 按1∶10的比例将称量后大鼠右肺组织块生理盐水冲洗后加入相应的裂解液中，充分混匀后低温离心，离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。加入缓冲液，100 ℃变性，取20 μg电泳，电泳完毕后转印至PVDF膜。室温下将膜封闭于5%的脱脂奶粉中1 h，加入一抗(ACTA2；CST公司)，在4 ℃下孵育过夜。隔日加入二抗(碧云天)，在室温下孵育1 h后使用TBST将膜充分洗涤，ECL检测标本膜上的信号。

2.5.4 统计学分析 各组数值用SPSS 21.0软件进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状况比较

两组大鼠均无死亡。两组大鼠熏烟初期均喜扎堆聚集，后渐出现咳嗽、喷嚏、喘息等症状。模型组大鼠精神倦怠、静卧懒动、呼吸困难，胸廓活动明显，出现点头运动，并有较多质地清稀的分泌物自鼻腔流出，毛发枯黄，部分大鼠有毛发脱落现象，饮食及摄水量减少，大便稀软，体质量减轻。而中药组大鼠一般状况较模型组有所改善。

3.2 PCR结果

中药组ACTA2mRNA的表达相比于模型组有所下调，表达丰度是模型组的0.718倍。P值为0.017，P<0.05，差异具有统计学意义。如图1、表2。

注：中药组与模型组比较，P<0.05。

表2 各组COPD大鼠ACTA2mRNA表达丰度

3.3 Western blot检测

中药组较模型组ACTA2mRNA蛋白表达降低。

4 讨论

近年来，我国40岁以上人群中COPD的发病率呈进行性增长，但其公众知晓率却未明显升高[11]。这也致使患者在首次求诊时大多症状已较为严重，给诊治增加了困难。目前COPD的西医治疗方案主要是通过应用支气管扩张剂(包括β2肾上腺素受体激动剂、抗胆碱能药物及茶碱类药)和糖皮质激素从而达到控制疾病发作的效果，但在临床工作中发现存在相当一部分的患者运用目前的治疗手段对症处理后病情并无明显的控制。该部分患者继发HPH的概率便会增加，其生活质量将会降低。而由于COPD患者的长期缺氧继发引起的HPH在发生初期并无明显的特异性临床表现，故许多COPD患者继发HPH时常不能获得明确诊断，延误病情，错过了早期的治疗时间。

图2 各组COPD大鼠ACTA2mRNA表达丰度

随着现代对传统医学研究的深入，中医药在内科学各方面疾病中表现出不俗的疗效。国内许多临床试验[12]已证实在COPD阶段进行中医药配合干预可以有效防治HPH的发生，达到“治未病”的效果。现代中医医家普遍认为COPD是一种病程较长，病性以虚为主的慢性虚损性肺系疾病。肺主一身之气，肾主纳肺吸入之清气，两脏协调有序则气机升降出纳均匀有度，卫气、宗气强劲，周转流利，诸邪不干。然，COPD患者多见为中老年人，年事渐高，素体渐衰，正气渐损。肺为娇脏，本就易感邪致病，脏腑正气一旦亏损则易令肺卫不固，致使邪气侵袭肺脏，进而使五脏六腑发生一系列生理及病理的变化，令病情迁延难愈。肺金与肾水为母子之脏，母病常多及子。久咳伤肺，肺病及肾，则肾气亏虚，肾虚不能摄纳，故常表现为肺气不足，肾纳气不利的症状。若肺脏吸入的清气不能被肾脏所摄纳，清气便游走于气道与血脉之间，无法与机体组织进行充分的气体交换，诱发低氧性肺动脉高压。明代医家李士材在《医宗必读》提出：“正气不足，而后邪气踞之”。《素问·评热病论篇》亦有云曰：“邪之所凑，其气必虚”。因此，在COPD的中医治疗过程中，应重视补肾益肺，始终注意扶正培本。肺气与肾气得到补充便能更充分发挥脏腑功能，吸纳更多的自然清气来缓解缺氧症状，从根本上调节肺动脉的压力。这也与现代医学认为提高机体免疫力可改善COPD患者一般情况的观念相符合。全真一气汤全方扶正祛邪，润燥合宜，是治疗肺肾气虚，肾不纳气的名方。方中熟地黄味甘性微温，入肝肾二经，为君药，配伍臣药味甘性微寒之麦门冬，上可养阴润肺，下可滋阴济肾；佐以性温之生晒参大补元气，性大热之黑顺片补火助阳；君臣二药药力所化阴液得参、附温热之性以气化，上则布津散液于肺，益肺生津，下则输精于肾，补肾填精；白术为甘温之药，归脾胃经，炒制更添健脾益气之效，与君臣二药共剂相配，补益脾土而不至温燥太过，滋补阴液而不过分黏滞；而牛膝作为引经药，引火下行，再加五味子纳气藏源，则可使土金水三脏均调，一气而化源。

ACTA2基因位于人类染色体10q23.31，其编码的ACTA2是人类目前已确定的6种肌动蛋白亚型之一。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的收缩过程依赖于由ACTA2组成的微丝与由β-肌球蛋白组成的粗丝之间的循环相互作用[13]。目前研究发现，ACTA2与烟雾病[14]、动脉瘤[15]、器官纤维化[16]等疾病的发生有着密不可分的关联。肌动蛋白是构成细胞骨架的关键结构。这种基因的突变或缺失会致使ACTA2构成细胞骨架的功能发生缺陷[17]，诱发与血管疾病有关的多系统平滑肌功能障碍。动脉血管的缩窄[18]便是该类患者其中的病理特征之一。当表达ACTA2的平滑肌细胞大量沉积肺动脉壁中，肺血管便会发生重构，导致肺动脉血管的高压力的产生，甚至发生右心衰[19]。我们可以认为，肺血管管腔的缩小是肺血管重构的直接结果，肺动脉高压是肺血管管腔缩小的症状表现。而除了血管重构之外，肺血管的收缩也会导致肺血管管腔的缩小。COPD患者由于持续的气流受限，导致肺通气功能发生障碍从而发生缺氧，表现出不同程度的低氧血症。机体可通过收缩肺肌性小动脉重新分配血液，将其由低通气肺泡调节至通气好的肺泡中，从而减轻低氧状态下肺部通气/灌注不匹配的情况。由于COPD患者缺氧状态持续进行且不可逆，会引起肺血管的逐步收缩，导致肺动脉压力逐步增加。通过对COPD患者继发HPH的相关危险因素分析也发现肺动脉压力与血氧饱和度之间存在较高相关性[20]。由于氧传感器感知到血氧分压(Partial pressure of oxygen，PO2)的降低，导致能引起肺动脉收缩的细胞信号系统被激活[21]。因此，低氧被视为是引起PASMCs收缩，致使HPH形成的原因之一[22]。

以往关于PASMCs收缩机制的研究多集中在离子通道、血管活性因子及气体信号分子等方面。如 Ca2+浓度增加是平滑肌收缩的直接因素[23]。缺氧可以引起肌浆网钙离子释放肌醇和细胞外钙离子内流，增加胞内游离钙水平，触发PASMCs收缩。ET-B和PGI2等[24-25]血管活性因子表达异常是导致低氧性肺血管收缩的因素。NO[26]、CO[27]、H2S[28]及H2[29]等气体具有舒张血管的作用。近些年的研究却发现，某些非编码的RNA(如circRNA、microRNA)在HPH的发生发展的过程中发挥过作用。这也让众多学者把研究方向集中在探究非编码RNA的信号通路及靶点等领域。Tang[30]等研究报道，ACTA2的表达受转化生长因子-β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)及神经调节蛋白1的胞内结构域(Intracellular domain of NRG-1，NRG-1-ICD)的影响。TGF-β1是一种可以调节免疫应答、调控细胞增殖分化等活动的多功能性调节因子[31]。除了可以通过促进人PASMCs的增殖和迁移诱使血管重构的发生外[32]，TGF-β1还可以增加ACTA2的基因表达[33-34]。在缺氧诱导的人PASMCs中观察到作为血管生成积极调节因子的TGF-β1显著上调[35]。表达上调的TGF-β1正反馈于神经调节蛋白1(Neuregulin-1，NRG-1)，增强了NRG-1的表达[36]，刺激并增强NRG-1-ICD进入细胞核调控基因表达的功能[37]。NRG-1-ICD在进入细胞核后能与ACTA2基因的第一个内含子结合并诱导circACTA2生成，而作为“分子海绵”的circACTA2可以通过对MiR-548f-5p的吸附从而解除其对ACTA2表达的抑制[38]，进而上调ACTA2的表达，促进VSMCs中张力纤维的形成和细胞的收缩[36-37]。

目前现代药理学中关于全真一气汤组方药物对ACTA2基因及其蛋白水平表达的影响的研究寥寥无几。目前仅有研究发现白术内酯Ⅰ具有抑制TGF-β1信号通路的表达强度及降低ACTA2的合成的作用[39]。已知TGF-β1能调控ACTA2的表达，故我们推测组方药物的部分成分可能通过对TGF-β1的影响，从而间接调控ACTA2的表达，实现对VSMCs收缩功能的调节。研究建立COPD大鼠模型并利用全真一气汤对COPD大鼠进行灌胃干预后发现，中药组大鼠的肺组织内ACTA2mRNA的表达丰度是模型组的0.718倍，ACTA2蛋白表达下调，表明全真一气汤可能通过下调ACTA2的表达及活化，调节COPD大鼠PASMCs的收缩功能，从而延缓HPH的发展进程。然而，全真一气汤生药汤剂化学成分复杂，本研究尚未明确能使ACTA2蛋白表达下调的具体成分，后续研究中可在此方面进行深入发掘。