沉香提取物对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

马家乐，符昭君，王鑫玉，靳凤玉，赵一慕，孟英心，王凌潇，李 军，郑 姣

沉香提取物对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

马家乐，符昭君，王鑫玉，靳凤玉，赵一慕，孟英心，王凌潇，李 军*，郑 姣*

北京中医药大学中药学院 中药现代研究中心，北京 100029

利用皮质酮诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12损伤，模拟糖皮质激素诱发神经功能障碍的病理过程，探讨沉香提取物对神经细胞的保护作用及其机制。采用400 μmol/L皮质酮诱导的PC12细胞作为神经元损伤模型，给予沉香提取物（5、10、20 μg/mL）干预细胞24 h后，利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率；采用Hoechst 33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡率；通过Western blotting检测凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、cleaved PARP表达情况。与对照组比较，皮质酮处理PC12细胞24 h后细胞存活率显著降低（＜0.01），细胞凋亡率显著升高（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平显著升高（＜0.01）。与模型组比较，给予沉香提取物24 h后细胞存活率显著升高（＜0.05、0.01），凋亡率显著降低（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平显著降低（＜0.01）。沉香提取物通过调控Caspase-3/PARP通路改善皮质酮诱导的PC12细胞凋亡，从而保护神经元。

沉香；PC12细胞；神经损伤；皮质酮；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶

重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一种常见的致残性精神障碍疾病，影响着全世界约3.5亿人[1-2]。当抑郁症发生时，机体感受到应激源激活下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA）轴，从而导致肾上腺皮质合成糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）。GCs在机体代谢、免疫功能等多种生命活动过程的调节中起着至关重要的作用。GCs的分泌和血液中GCs的水平可通过HPA轴的负反馈抑制来调节[3]。由于极端或慢性压力，持续暴露于血液中高浓度的GCs会导致HPA轴和负反馈机制的功能障碍，导致GCs过度分泌，从而对神经系统造成损害[4]。中枢神经系统慢性应激诱导的神经元细胞死亡是神经功能障碍的原因之一，包括记忆丧失、学习障碍和认知障碍，还可能引发焦虑和抑郁等精神障碍[5]。啮齿动物体内的GCs主要是皮质酮，由于HPA反馈功能障碍，持续暴露于高浓度皮质酮可引起病理性海马神经元损伤，诱发抑郁样行为[6]。因此，改善皮质酮诱导的神经元损伤已成为治疗焦虑和抑郁的潜在靶标。

沉香为瑞香科沉香属植物白木香(Lour.) Gilg含树脂的木材，是沉香四味散、八味沉香散、沉香化气丸等经典名方的主要组成药味。沉香作为名贵中药材已有千年应用历史，被列为“沉檀龙麝”四香之首，具有非常宝贵的药用价值。沉香作为药物始载于梁代陶弘景的《名医别录》，名列上品，曰：“沉香、薰陆香、鸡舌香、藿香、詹糖香、枫香并微温。悉治风水毒肿，去恶气”。在《本草纲目》中，李时珍就用“去恶气，清人神”来描述沉香的功效。现代药理学研究表明，沉香具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁的作用，但仅为活性筛选和药效评价，尚未深入阐明沉香镇静安神的作用机制[7-10]。大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12是一种具有典型神经元特征并具有高水平GCs受体的细胞系，已被用作模拟高浓度皮质酮刺激时海马神经元损伤的经典模型。因此本研究利用皮质酮诱导的PC12细胞模型，初步探究沉香提取物的神经保护作用和机制，为沉香防治抑郁症提供研究基础和依据。

1 材料

1.1 细胞

PC12细胞由北京大学曾克武教授赠予。

1.2 药材

沉香购自海南，经北京大学屠鹏飞教授鉴定为瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg含树脂的木材。

1.3 试剂

DMEM培养基（批号11965092）、青霉素-链霉素双抗（批号15140163）、胎牛血清（批号12483020）、PBS溶液（批号20012050）、胰酶（批号25200072）均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒（批号BN15201）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；皮质酮（批号S30265）购自上海源叶生物科技有限公司；Hoechst 33258（批号23491-45-4）购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）双染细胞凋亡试剂盒（批号556547）购自美国BD公司；RIPA裂解液（批号P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号14220S）、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]抗体（批号9532T）、β-actin抗体（批号3700T）、HRP标记的山羊抗兔抗体（批号7074P2）均购自美国CST公司。

1.4 仪器

多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司）；冷冻离心机（美国Eppendorf公司）；CriterionTM型电泳槽（美国Bio-Rad公司）；DYY-6D型电泳仪（北京六一仪器厂）；细胞培养箱（日本Sanyo公司）；倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；分析型高效液相色谱仪（HPLC，日本岛津公司）。

2 方法

2.1 沉香提取物的制备

取沉香药材粉末10 kg，分别用10、8、8倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，共得到3 kg浸膏，即为沉香提取物（由北京中医药大学现代研究中心化学实验室提供）。经HPLC检测沉香提取物中沉香四醇质量分数为1.89%。

2.2 PC12细胞培养

PC12细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM完全培养基，于5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养。待2～3 d细胞融合度达到80%时，用0.125%的胰酶消化，进行传代处理。

2.3 皮质酮对PC12细胞存活率的影响

取对数生长期的PC12细胞，以4×104/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h。设置空白组、对照组和实验组。空白组不加入细胞，加入完全培养基后不做任何处理；对照组用完全培养基正常培养PC12细胞；实验组分别加入100 μL终浓度为200、400、600、800、1000 μmol/L的皮质酮处理细胞。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育1 h，采用酶标仪测定490 nm处的吸光度（）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(实验－空白)/(对照－空白)

2.4 沉香提取物对PC12细胞存活率的影响

取对数生长期的PC12细胞，以4×104/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h。设置空白组、对照组和实验组。空白组不加入细胞，加入完全培养基后不做任何处理；对照组用完全培养基正常培养PC12细胞；实验组分别加入100 μL终质量浓度为10、50、100、200 μg/mL的沉香提取物处理细胞。培养24 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率。

2.5 沉香提取物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型细胞存活率的影响

取对数生长期的PC12细胞，以4×104/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h。设置空白组、对照组、模型和给药组。空白组不加入细胞，加入完全培养基后不做任何处理；对照组用完全培养基正常培养PC12细胞；模型组和给药组加入终浓度为400 μmol/L的皮质酮；给药组再分别加入终质量浓度为5、10、20 μg/mL的沉香提取物处理细胞。培养24 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率。

2.6 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况

取对数生长期的PC12细胞，以8×104/mL接种于6孔板中，培养过夜。按“2.5”项下方法分组及给药，吸去培养液，加入0.5 mL 4%多聚甲醛组织固定液，固定20 min；PBS溶液洗涤2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃避光染色20 min；PBS溶液洗涤2次，于荧光显微镜下观察各组细胞形态并拍照。

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

按“2.6”项下方法分组及给药，用0.125%胰酶消化成单细胞悬液，收集细胞；PBS溶液洗涤2次，1000 r/min离心5 min，收集细胞；加入190 μL 1×Binding Buffer混悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，避光室温放置10 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.8 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白表达

按“2.6”项下方法分组及给药，PBS溶液洗涤2次，于冰上用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白，99 ℃加热10 min使蛋白变性。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭1 h，分别加入Caspase-3、PARP、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔抗体，4 ℃孵育4 h；TBST洗涤3次后显影成像，用Image J软件进行灰度分析。

2.9 统计学分析

实验数据采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，两组之间比较采用检验。

3 结果

3.1 皮质酮对PC12细胞存活率的影响

如图1所示，皮质酮（200、400、600、800、1000 μmol/L）刺激PC12细胞24 h后，细胞存活率均显著降低（＜0.01），表明皮质酮能抑制PC12细胞生长，且呈剂量相关性。400 μmol/L皮质酮刺激PC12细胞24 h后，细胞存活率为50%，因此选择400 μmol/L皮质酮刺激PC12细胞24 h作为神经元细胞损伤模型的实验条件。

与对照组比较：##P＜0.01，图2同

3.2 沉香提取物对PC12细胞存活率的影响

如图2所示，与对照组相比，沉香提取物（10、50、100 μg/mL）对PC12细胞存活率无显著影响，沉香提取物（200 μg/mL）组PC12细胞存活率显著降低（＜0.01）。因此后续沉香提取物给药质量浓度控制100 μg/mL以内。

3.3 沉香提取物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型细胞存活率的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组PC12细胞存活率显著降低（＜0.01）；与模型组比较，沉香提取物组细胞存活率均显著升高（＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。提示沉香提取物对皮质酮诱导的神经元损伤有良好的保护作用。

图2 沉香提取物对PC12细胞存活率的影响(, n = 3)

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同

3.4 沉香提取物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型细胞凋亡的影响

Hoechst 33258染色剂是一种核酸染料，能将凋亡细胞的细胞核标记为亮蓝色荧光。Hoechst染色结果见图4，其中箭头所指向为凋亡细胞，与对照组对比，模型组发出亮蓝色荧光的细胞数量明显增多，表明皮质酮能够导致PC12细胞损伤并诱发细胞凋亡；沉香提取物组发出亮蓝色荧光的细胞数目明显减少，且呈剂量相关性，表明沉香提取物能够抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术是一种极为灵敏的细胞凋亡检测手段。采用Annexin V-FITC/PI双染法对PC12细胞进行染色后，利用流式细胞仪对处于不同阶段的细胞进行分选。结果如图5所示，与对照组相比，模型组Q2象限晚期凋亡和Q4象限早期凋亡细胞均明显增加，细胞凋亡率显著升高（＜0.01），表明皮质酮诱导PC12细胞凋亡；与模型组比较，沉香提取物组Q2和Q4象限细胞减少，细胞凋亡率降低，呈剂量相关性，其中沉香提取物（20 μg/mL）组具有显著性差异（＜0.01），表明沉香提取物可通过抑制PC12细胞凋亡发挥保护作用。

箭头所指为凋亡细胞

3.5 沉香提取物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型凋亡相关蛋白的影响

当细胞发生凋亡时，Caspase-3发生剪切变成cleaved Caspase-3，同时激活PARP，诱导PARP蛋白发生剪切化，因此检测Caspase-3和PARP以及相应的剪切态的蛋白表达，进而探究沉香提取物调控PC12细胞凋亡的靶点。如图6所示，与对照组比较，模型组细胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平显著升高（＜0.01）；与模型组比较，沉香提取物组细胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平显著降低（＜0.01），表明沉香提取物可以通过调控Caspase-3/PARP抑制PC12细胞凋亡，从而起到细胞保护作用。

4 讨论

MDD是一种精神健康障碍，是造成全球疾病负担的主要因素，其特征为普遍且持续的情绪低落，目前已经成为普遍关注的热点[11]。然而，由于其发病机制不明、致病因素复杂，临床上使用的经典抗抑郁药的疗效并不理想[12]。苯二氮类药物的长期使用或联合使用药物可能会导致药物成瘾、嗜睡、运动障碍等严重的不良反应[13]。因此，寻找长期使用安全且不会造成严重不良反应的天然药物十分必要。中药沉香作为传统的理气药，其化学成分和活性已被广泛报道[14-15]。Wang等[16]通过动物行为学实验，证明了沉香挥发油具有抗焦虑和抗抑郁作用；王灿红等[17]通过化合物靶点预测发现沉香有抗焦虑和抗抑郁的“双重调节”作用。然而，目前还没有关于沉香对于GCs诱导的神经元损伤的神经保护作用及其潜在机制的研究。

本课题组前期研究表明，持续暴露于高浓度GCs可抑制神经元生长和分化，导致海马神经细胞DNA损伤，最终导致细胞凋亡[18]。用高浓度的皮质酮诱导PC12细胞已被用作模拟神经元损伤的体外经典实验模型。本研究通过不同浓度的皮质酮处理PC12细胞建立神经元损伤细胞模型，发现皮质酮显著降低PC12细胞存活率，并以剂量相关性方式加剧细胞死亡，故选择400 μmol/L皮质酮刺激PC12细胞24 h作为神经元细胞损伤模型的实验条件。如果能保护神经元免受皮质酮的损伤，慢性应激引起的神经功能障碍可能会减少。因此从神经元细胞保护的角度，探究沉香提取物的抗抑郁作用。通过CCK-8法检测PC12细胞存活率，发现给予沉香提取物后，细胞存活率呈剂量相关性升高，提示沉香提取物对皮质酮诱导的神经元损伤有良好的保护作用。通过Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测PC12细胞凋亡情况，结果与文献报道一致[19]，皮质酮能够诱导PC12细胞的凋亡，沉香提取物可以剂量相关性地抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡。

为了探究沉香提取物抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡的作用机制，考察细胞程序性凋亡途径相关蛋白Caspase-3/PARP以及对应剪切态蛋白的表达。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，部分或全部负责许多关键蛋白质的蛋白水解裂解。Caspase-3激活后进一步切割PARP并触发染色体DNA断裂和片段化，最终导致细胞凋亡[20]。Western blotting结果显示，皮质酮处理后能激活Caspase-3和PARP的剪切，而沉香提取物以剂量相关性方式降低了cleaved PARP和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。表明皮质酮诱导PC12细胞DNA片段化并触发细胞凋亡，沉香提取物能有效地抑制细胞凋亡，从而起到细胞保护作用。

综上，本研究发现沉香提取物能够通过调控Caspase-3/PARP蛋白，抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡，从而发挥神经元保护作用，沉香提取物可以作为一种神经保护剂用于受到皮质酮损伤的神经细胞，为沉香治疗焦虑与抑郁的临床应用提供理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Protective effect and mechanism ofextract on corticosterone induced PC12 cells injury

MA Jia-le, FU Zhao-jun, WANG Xin-yu, JIN Feng-yu, ZHAO Yi-mu, MENG Ying-xin, WANG Ling-xiao, LI Jun, ZHENG Jiao

Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Corticosterone was used to induce the injury of rat adrenal medulla pheochromocytoma cell line PC12 to simulate the pathological process of glucocorticoid-induced neurological dysfunction, so as to explore the protective effect and mechanism of Chenxiang () extract on nerve cells.PC12 cells induced by 400 μmol/L corticosterone were used as neuron injury model. After 24 h of intervention withextract (5, 10, 20 μg/mL), cell survival rate was detected by CCK-8 kit; Hoechst 33258 staining and flow cytometry were used to detect cell apoptosis rate; Western blotting was used to detect apoptosis-related proteins cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) and cleaved PARP expressions.Compared with control group, survival rate of PC12 cells treated with corticosterone for 24 h was significantly decreased (< 0.01), apoptosis rate was significantly increased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, survival rate of P12 cells treated withextract for 24 h was significantly increased (< 0.05, 0.01), apoptosis rate was significantly decreased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly decreased (< 0.01).extract improves corticosterone-induced apoptosis of PC12 cells by regulating PARP/Caspase-3 pathway, thereby protecting neurons.

; PC12 cells; nerve injury; corticosterone; apoptosis; Caspase-3; poly(ADP-ribose)polymerase

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1093 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.016

2021-11-03

国家自然科学基金资助项目（82003912）；国家重点研发项目（2018YFC1706400）

马家乐（1997—），女，硕士研究生，研究方向为中药药理学。Tel: 17864191175 E-mail: 17864191175@163.com

李 军，博士生导师，研究员，主要从事中药药效物质及作用机制研究。E-mail: drlj666@163.com

郑 姣，硕士生导师，副研究员，主要从事中药药理研究。E-mail: zj98v2@163.com

[责任编辑 李亚楠]