不同粒径10%戊唑醇悬浮剂对非靶标生物毒性和抑菌活性比较

葛兆悦，袁善奎，张小军，侯玉霞

(1.农业农村部农药检定所，北京 100125；2.农业农村部农药评价重点实验室，北京 100125；3.中农立华生物科技股份有限公司，北京 100052; 4.中国农业大学理学院，北京 100193)

农药从原药加工成制剂产品后，其有效成分的粒径在产品稳定性、靶标生物活性和持留期方面起着至关重要的作用。农药悬浮剂是原药与助剂等分散在水中经研磨后制得的悬浮液体，有效成分以固体微粒形式稳定的分散在水中，微粒的粒径通常在4μm以下，被认为是高效、环保的水基化剂型。一般来说，农药粒径减小，粒径分布变窄，分散性和渗透性更好，生物活性越高，从而间接影响到制剂产品对环境非靶标有益生物的毒性及对靶标的生物活性，但农药制剂粒径细化对设备要求高、研磨时间长、能耗也增加。因此，在实际农药悬浮剂剂型产品研发过程中，应从经济性、安全性、有效性等方面综合考虑设计粒径大小。

本研究以3μm、1μm和300nm等不同粒径的10%戊唑醇悬浮剂为试验材料，通过比较其对蜜蜂、家蚕、斑马鱼、大型溞和羊角月芽藻5种非靶标有益生物的毒性，以及在离体条件下对赤霉菌、稻瘟病菌和小麦白粉病菌的抑菌活性和活体上黄瓜白粉病的防治效果，综合分析粒径大小对戊唑醇悬浮剂生态毒性和抑菌活性的影响，旨在为开发经济、高效和环保的农药悬浮剂提供参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂 300nm、1μm 、3μm粒径的10%戊唑醇悬浮剂，所用助剂均为TAMOL DN、Sokalan CP-9 、1,2-丙二醇、SAG 1522、黄原胶、卡松等；95%戊唑醇原药。

1.1.2 供试非靶标有益生物 意大利成年工蜂，购自中国农科院蜜蜂研究所；家蚕，蚕卵购自山东广通蚕种集团有限公司，品种为菁松×皓月；斑马鱼，购自北京宏大高峰水族用品经营部；大型溞和羊角月芽藻，购自中国科学院水生生物研究所。

1.1.3 供试植物病原菌 小麦赤霉菌、稻瘟病菌、小麦白粉病菌、黄瓜白粉病菌菌株均由农业农村部农药检定所实验室保存。

1.1.4 供试植物品种 小麦品种为淮麦33，黄瓜品种为北京刺瓜。

1.2 非靶标生物毒性测试方法

1.2.1 蜜蜂急性经口毒性试验 参照GB/T 31270.10[1]方法，用50%蔗糖水将供试药剂配制不同浓度药液，将贮蜂笼内的蜜蜂引入试验笼中，饲喂器中加入试验药液，供蜜蜂摄食。试验温度25±2℃，相对湿度50%～70%，光照条件为黑暗，试验开始后24、48h观察并记录蜜蜂中毒症状及死亡数。

1.2.2 家蚕急性毒性试验 参照GB/T 31270.11[2]浸叶法，供试用蚕为二龄起蚕，试验温度均为25±1℃，相对湿度70%～80%，光照/黑暗时间比16/8h，试验开始后24、48、72和96h观察并记录家蚕中毒症状及死亡数。

1.2.3 大型溞急性活动抑制试验 参照GB/T 31270.13[3]静态法，试验水温20±1℃，光照/黑暗时间比16/8h，试验周期48h。试验开始后24、48h观察并记录大型溞的中毒症状和受抑制数。

1.2.4 斑马鱼急性毒性试验 参照GB/T 31270.12[4]静态法，试验水温24±1℃，光照/黑暗时间比16/8h，每隔48h更换一次试验药液，试验周期96h。试验开始后24、48、72和96h观察并记录斑马鱼的中毒症状及各处理的死亡数。

1.2.5 藻类生长抑制试验 参照GB/T 31270.13[5]方法，将绿藻染毒后放入智能人工气候箱，培养温度22±1℃，光照/黑暗时间比16/8h，试验周期72h。试验开始后24、48、72h，用分光光度法测定各处理藻液细胞浓度。

1.2.6 大型溞繁殖试验 参照GB/T 21828-2008[6]方法，试验开始后每48h更换试验药液，试验水温20±1℃，光照/黑暗时间比16/8h，试验周期21d内，每24h观察记录产溞数，并取出新生幼溞。

1.3 对植物病原菌的活性测定方法

1.3.1 小麦赤霉菌的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法，将直径5mm的小麦赤霉菌菌饼接种在含有系列梯度供试药剂的PDA平板中心，于25℃培养96h，十字交叉法测定菌落直径，计算生长抑制率。

1.3.2 稻瘟病菌的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法，将直径5mm的稻瘟病菌菌饼接种在含有系列梯度供试药剂的PDA平板中心，于25℃黑暗培养7d，十字交叉法测定菌落直径，计算生长抑制率。

1.3.3 小麦白粉病菌的室内毒力测定 采用离体叶段法[7]，室内盆栽的健康小麦长至一叶一心后，剪取2cm长第一叶上部叶段，系列梯度药液浸湿，晾干后放置在含相应浓度供试药剂和50mg/L苯并咪唑的固体琼脂培养基表面，用抖落孢子法接种，置于恒温培养箱，温度18℃，光照/黑暗时间比16/8h，培养7d，按发病情况分级标准记录病情，计算相应的病情指数和防治效果。

1.3.4 黄瓜白粉病的防治效果测定 采用盆栽测定法[8]，黄瓜两片真叶展开后，使用喷雾器将系列梯度药液均匀喷洒于盆栽黄瓜叶片正面，至药液刚好不下滴，自然晾干。 24h后收集新鲜病叶上的黄瓜白粉，配制浓度为4.0×104个/mL孢子悬浮液，均匀喷洒于盆栽黄瓜叶片。室内温度25℃培养至对照明显发病，参照《农药田间药效试验准则 杀菌剂防治黄瓜白粉病》调查发病情况，并计算相应的病情指数和防治效果。

1.4 数据分析 用SPSS 22.0处理试验结果。急性毒性试验分别计算供试药剂对试验生物的半致死剂量(LD50)、半致死浓度(LC50)、抑制效应浓度(EC50)，及95%置信区间，比较各药剂之间毒性的差异显著性。大型溞繁殖试验的试验数据，采用单因素方差分析(P<0.05)，得出不同药剂处理下产溞总数的无可观察效应浓度(NOEC)、最低可观察效应浓度(LOEC)。室内毒力测定试验分别计算供试药剂对病原菌生长半抑制效应浓度(EC50)或防治效果及95%置信区间，比较各药剂之间室内抑菌活性的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 对非靶标生物的毒性

2.1.1 急性毒性 供试药剂对非靶标生物急性毒性试验结果(表1～5)。结果表明，在3个不同粒径的10%戊唑醇悬浮剂，300nm 粒径对蜜蜂急性经口毒性为中毒(其他为低毒)，对家蚕急性毒性均为低毒，对大型溞、斑马鱼急性毒性均为中毒，总体上表现出对上述4种生物随着粒径变小毒性升高的趋势。3种制剂对羊角月芽藻生长抑制毒性均为中毒，表现出粒径变小毒性降低的趋势，1μm和300nm粒径10%戊唑醇悬浮剂 显著低于3μm粒径10%戊唑醇悬浮剂。

表1 对蜜蜂的急性经口毒性

表2 对家蚕的急性毒性

表3 对大型溞的急性活动抑制毒性

表4 对斑马鱼的急性毒性

表5 对羊角月芽藻的生长抑制毒性

2.1.2 对大型溞的繁殖毒性 统计试验期间各个母溞的产溞总数，以供试药剂对21d大型溞繁殖量(每只非意外死亡的亲溞所产幼溞总数)的影响作为评价指标，基于设计浓度，得到供试药剂处理的大型溞21d产溞总数NOEC为0.393mg a.i./L，LOEC为0.492mg a.i./L，不同粒剂的10%戊唑醇悬浮剂对大型溞的繁殖无显著差异。

2.2 对植物病原菌的抑制活性

2.2.1 离体抑菌活性 粒径为3μm、1μm、300nm的3种10%戊唑醇悬浮剂对小麦赤霉菌、稻瘟病菌、小麦白粉病菌的室内毒力测定结果(表6～8)。结果表明，戊唑醇对不同病原菌的活性不同。对于同一种病原菌，不同粒径的戊唑醇悬浮剂的抑菌活性无显著差异。

表6 对小麦赤霉菌的抑菌活性

表7 对稻瘟病菌的抑菌活性

表8 对小麦白粉病菌的抑菌活性

2.2.2 活体上的抑菌活性 在活体黄瓜小苗上，50mg a.i./L浓度的3μm、1μm、300nm10%戊唑醇悬浮剂处理的黄瓜白粉防治效果分别为22.2%、27.8%、16.7%，100mg a.i./L浓度处理的防治效果分别61.1%、61.1%、66.7%，未表现明显的抑菌活性差异。

3 结论与讨论

有效成分颗粒粒径是农药制剂重要的物理参数之一。农药粒径大小对其毒性的影响早有研究，主要针对溶解度低的原药和粉剂，如百菌清原药、吩噻嗪、硫磺粉等[9]，通常认为水中溶解度增加、接触几率的提高是生物活性提高的原因。本研究中，蜜蜂急性经口试验的剂量对应的药剂浓度最高，远高于戊唑醇在水中的溶解度，粒径大小对分散性能的影响最为显著，相应地由于对水生生毒性试验设计浓度较低，粒径大小的影响在溶解的过程中被削弱，所以导致毒性差异小或无显著差异。与其他非靶标生物相比，悬浮剂粒径大小对藻类的毒性影响呈现不同趋势，即粒径越小，对藻类毒性越低，这可能是粒径越大对藻细胞的物理吸附性越强，从而影响其生长。

农药颗粒粒径也会影响其药效，如早已证实颗粒粒径在微米范围内，几微米的农药颗粒杀菌、杀虫活性远高于十几微米或几十微米的农药颗粒[9]。本章研究中，300nm～3μm范围内，粒径大小对戊唑醇悬浮剂在离体条件下小麦赤霉菌、稻瘟病菌、小麦白粉病菌的抑制活性以及在黄瓜活体上黄瓜白粉病的防治效果也无明显影响，但更小粒径的制剂也可能会对药效产生较为显著的影响。

综上所述，本研究证明对于10%戊唑醇悬浮剂，在300nm～3μm粒径范围内，粒径变化对非靶标生物的毒性有一定的影响，但对植物病原菌的活性方面没有造成显著影响，该制剂在300nm甚至100nm以下是否会对毒性和抑菌活性造成显著影响尚待进一步研究。近年来，纳米农药已成为研究的热点，农药制剂纳米化之后是否会提高其对环境生物的风险应值得关注，在实际产品开发中涉及有效成分粒径范围时应综合考虑提高药效和改变环境安全性方面的影响。