毛细管与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测甜菜SSR位点的比较研究

冯琬淇，张福顺，刘乃新

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)为苋科(Amaranthaceae)甜菜属(Beta L.)。糖甜菜、根甜菜、叶甜菜、饲料甜菜是4种栽培变种，糖甜菜是世界上重要的糖料作物[1]，也是新兴的能源作物，在农业产业结构调整和发展地方经济中同样有着重要地位[2]；根甜菜和叶甜菜均可食用，尤其是根甜菜有很高的药用价值[3-4]和营养价值[5-6]，现有多个国家进行种植[7]；而饲料甜菜由于其含糖量低，块根大而主要被用于畜牧业。

分子标记技术是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种基于蛋白质和核酸分子突变的理想的遗传标记形式[8]。SSR分子标记技术具有带型整齐、退火温度高、重复性好、共显性及操作简单等特点而得到了广泛的应用[9-10]。为了测定不同品种SSR位点的多态性，多态片段的分离常用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来检测[11-12]。

毛细管电泳是最近几年发展起来的技术，并不断成熟，主要用于多肽、蛋白质、核酸、离子和药物的分离和测定[13]，技术原理是利用电场作为驱动力，毛细管作为通道，根据分子量或碱基逐个分离，可以同时检测多个样品和多个标记，大大提高了检测效率和精确度[14-15]。2010年梁俊等[16]使用了SSR标记和毛细管电泳对甘蔗进行了遗传分析，结果表明SSR分子标记与毛细管技术结合，相比别的分子标记技术或电泳技术，具有更准确、简便、自动化等优点；2011年陈雅琼等[17]利用SSR荧光标记和毛细管电泳对烟草进行了遗传分析，结果表明荧光检测法克服了银染法的不足，具有简便、可靠及高通量的优点；2017年郭正兵等[18]通过SSR荧光标记毛细管电泳分析了30份无花果品种遗传多样性，发现了30份无花果品种资源表现出比较丰富的遗传多样性；2018年胡依依等[19]进行了聚丙烯酰胺凝胶与毛细管电泳检测龙须菜SSR位点的比较研究经，测序检验，PAGE结果均准确，而毛细管电泳分型结果出现误差。在样本量少，SSR位点的变异小时,使用PAGE检测SSR位点更为准确。

本研究选择8个甜菜品种，8对SSR引物，利用聚丙烯酰胺电泳和毛细管电泳两种检测平台，来检验引物对品种的鉴定效果，为进一步甜菜品种鉴定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 植物材料

选取8个不同的甜菜品种，具体实验材料见表1。将种子播种于营养钵中，在室温20℃，光照3500 lux的条件下培养10天，待幼苗长至5 cm左右剪下，用无菌水冲洗干净并晾干备用。

表1 甜菜品种信息表

1.2 主要试剂及仪器

PCR扩增所用的主要试剂2xTaq PCRM ix、50 bp Marker购自大连宝生物有限公司；引物由擎科生物有限公司合成。主要仪器有JY-JX5北京君意东方电泳仪，Nanodrop one超微量分光光度计，Thermal Cycler C1000 Touch型PCR仪，ABI3730高通量基因分析仪。

1.3 甜菜基因组DNA模板的提取

用CTAB法提取基因组DNA[20]，样品放入-20℃冰箱中保存备用。

1.4 SSR引物扩增

选择8个SSR位点设计引物，具体引物信息见表2。常规反应体系：在20μL的反应体系中包括：100 μmol/L的上下游引物各 1μL，M IX（2×DNA Polymerase、Buffer、dNTPM ixture），2×Taq PCR M ix 10μL，10 ng/μL的DNA模板2.0μL，灭菌超纯水补足至20μL，旋涡振荡混匀。PCR反应程序为：95℃预变性3m in；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次；最后再72℃延伸5m in。

1.5 SSR扩增产物检测

1.5.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检测。在180V恒压条件下电泳50m in。用改良的银染法进行染色显影[21]。然后放置在白光板上拍照保存。

1.5.2 毛细管电泳检测 将表2中SB13、Bvv23和GTT1合成ROX标记的荧光引物，BvCA2、SB15和Bvv45合成FAM（蓝）标记的荧光引物，SSD6、SB06合成HEX（绿）标记的荧光引物，随后进行PCR扩增，等体积混合不同荧光标记扩增产物，混匀后从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5m in后取出，立即置于碎冰上，冷却10m in以上，离心10 s后放置到DNA分析仪上，随后利用ABI3730XLDNA序列分析仪进行毛细管电泳，检测目的产物的片段大小，得到初始数据后用Gene Marker V2.2.0进行分析并得到峰图。

表2 SSR引物

2 结果与分析

2.1 PAGE胶检测结果

根据PAGE胶上不同个体之间的差异性条带可以得到每条条带上的等位基因数目，等位基因数目为3个的多态性SSR位点包括BVV45、SB15和SSD6，等位基因数目为2个的多态性SSR位点包括BVV23、GTT1、SB06和SB13，而非多态性SSR引物包括BVCA2，如图1所示。

图1 引物PAGE胶检测结果

2.2 毛细管电泳检测结果

根据毛细管电泳分型结果分析，引物BvCA2、Bvv23分别在8个个体中出现2条不同分子量的DNA片段，引物SB13、SB06、GTT1、Bvv45分别在8个个体中出现3条不同分子量的DNA片段，引物SB15在8个个体中出现7条不同分子量的DNA片段。引物SSD6在8个个体中出现4条不同分子量的DNA片段，部分分型结果如下。图2、图3分别为SSR荧光标记电泳检测法对引物Bvv45、SB15扩增产物分析的结果。结果表明，Bvv45分别在8个个体中出现3种分型结果如图2，即140、212、231 bp；SB15引物在8个个体中出现了7种分型结果如图3，即138、143、147、152、153、154、168 bp，总体信号清晰，可以直观的看出不同峰型的碱基数，易于判断，可以用于鉴定8个体多态性的检测。

图2 引物Bvv45特征峰图

图3 引物SB15特征峰图

2.3 两种方法的检测结果比较

表3显示8个品种在8对SSR引物上的毛细管电泳和PAGE结果的比较，PAGE与毛细管电泳分型结果一致的位点包括SB13，而分型结果不一致的位点包括BvCA2、BVV23、BVV45、GTT1、SB06、SB15和SSD6，不同引物两种检测方法的匹配比率分别是75%、87.5%、50%、75%、25%、100%、37.5%、50%。毛细管电泳荧光标记法各分子样品中均含有分子量内标，因此可以准确的知道DNA片段的分子大小，当检测样品多时具有较高准确性；PAGE电泳检测不同样品的分子量时，只能用肉眼观察出与Marker比较估测得出大致分子量，不能得出准确分子量。

表3 8个甜菜品种在8对SSR引物上的毛细管电泳和PAGE结果比较

3 讨论与结论

3.1 PAGE电泳检测SSR的方法探究

用PAGE进行电泳时，可以选用6%或8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检测：有研究表明[22]，8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果由于凝胶浓度偏高，以致条带模糊、不齐整，泳道痕迹明显。6%的非变性聚丙烯酰胺的结果明显，没有拖尾，而且能将条带均匀分开，因此本实验采用6%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳。

并且判断SSR位点的多态性，需要得到稳定清晰的谱带，因此在做胶技巧、电泳时间、上样量、银染时间等因素上进行探究，得到以下经验：做胶时的玻璃板要彻底清洗干净，不能在上面有明显的胶块，否则在电泳结束时取下凝胶会使玻璃板与凝胶难以分离；缓冲液要定时更换，否则电泳时会使条带偏离难以辨认，影响结果的判断；上样时，一定要保证手稳，轻按移液器，让样品缓慢轻柔地沉入进样孔内，待全部样品挤出枪头后再缓慢拿走移液器，这样可以防止出现条带拖尾的现象；在银染时间上，也需要时刻注意，切勿染色太久，会导致凝胶颜色过深难以分辨条带，也不可以染色时间过短，导致条带与凝胶分离不开；电泳时间要控制在90min左右，时间过短不能使目标条带分离，会聚集在一起难以辨认，而电泳时间过长会使目标条带跑到非变性凝胶外面以至于弥散存在。

3.2 PAGE电泳与毛细管电泳检测SSR方法比较

毛细管电泳荧光标记法各分子样品中均含有分子量内标，因此可以准确的知道DNA片段的分子大小，当检测样品多时具有较高准确性，但是有的样品的检测结果丢失，峰图杂乱没有目标峰，如GTT1引物的4号样本和SB06引物的4号和7号样本，然而PAGE电泳检测目标条带明显，因此可以排除无效等位基因的可能[23]，比较分析原因可能是由于在进行荧光PCR时，加入的样品较少或忘记加入荧光引物，如果只依靠毛细管电泳结果则无法判断是否有无效等位基因。PAGE电泳检测不同样品的分子量时，只能用肉眼与Marker比较估测得出大致分子量，不能得出准确分子量。

利用PAGE电泳进行检测时，需要一板96孔板中的64格，进行电泳时只需两块玻璃胶，大约一小时后即可完成电泳银染的过程，因此效率较高，而进行毛细管电泳时，需要将PCR样品送到生物公司再进行检测，随后的数据整理过程也费时费力，因此，PAGE电泳具有效率高的优点。

目前，利用毛细管电泳荧光比较法的高通量、智能化等优点，分子标记技术得到了迅速发展，该方法具有较高的灵敏度能够较好地区分出不同的等位变异。传统的PAGE检验方式在样本数量较多时不仅耗时、费力，同时在对大量多批次的数据采集和分析过程中也有较大的缺陷，主要体现在对不同的等位变异数无法精确鉴定，对各个批次反映的数量也无法统一管理。毛细管检测技术的创新之处在于：与银染技术相比，荧光法具有更高的精度和效率，它能准确地计算出微卫星等位突变的扩增片段，使其与高效自动化技术相结合，并能有效地降低银染对环境的影响。

本研究实验中出现的特殊情况在跑PAGE胶是会出现不同程度的脱带，会导致银染所呈现的结果不清晰，读带不完整，因此可以看出普通的PAGE电泳具有实验上的误差，不够方便灵敏。荧光检测技术的限制因素在于PCR需要运送时间，数据分析也较为费力。

但是，由于毛细管检测法技术的费用较高，相比之下银染技术比较经济，常规使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳法和银染法可以很好的分辨出不同的种类，从而大大减少了测试费用。利用荧光法进行快速、高效、自动化的毛细管电泳技术已经成为当前生命科学的一个热点和焦点。大量的实验结果显示，毛细管电泳技术操作简单、准确性高、重复性好，特别是DNA片段多态性的检测，能更全面、准确地反映出DNA的多态性和多态性。试验结果表明，与传统的银染方法相比，这种方法具有更好的应用前景。结果表明，该技术正朝着简便、快速、高通量、自动化、智能化的方向发展。

综上，通过比较PAGE胶与毛细管荧光检测技术两种技术，当样品较少时利用PAGE电泳的方法来检测SSR位点的多态性，既能节省成本又能节省时间，还能保证检测结果的准确性，而样品较多并且经费充足时，可以使用毛细管电泳的方法，可以减少操作人员与有毒害的聚丙烯酰胺凝胶、银染液接触，将操作人员从大量枯燥重复的实验中解脱开来，自动上样的毛细管电泳可以提高工作效率，并且避免了由于人工操作引起的误差[24]。