基于网络药理学探讨徐长卿-紫草-地肤子治疗湿疹的作用机制*

李磊 吴东良阎玥 史琦 司东旭李友林**

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院国家中医药管理局重点研究室,中医药防治过敏性疾病北京市重点实验室，北京 100029)

湿疹是一种受遗传因素和环境因素影响的疾病，患病率日渐增长，其病理机制涉及全身以及皮肤的免疫与表皮功能障碍[1]，多表现为皮损局部浸润肥厚、剧烈瘙痒、易反复发作等症状。中医将湿疹归属于湿疮范畴，认为其发病与多种病因相关，禀赋不足，腠理不固而受外邪侵袭，加之饮食不节脾胃内伤，内外相合，精血不足，化风化燥，继而出现于机体不同部位，根据皮损形态不同，名称各异，如浸淫疮、粟疮、肾囊风、四弯风等。临床上徐长卿[2]、紫草[3]、地肤子[4]常用于湿疹的内治法和外治法中，现代研究提示，三者均对湿疹具有抗炎、抗过敏、免疫调节等作用[5-7]，这与三者清热祛风止痒的传统功效相吻合。但三者治疗湿疹的有效成分、作用靶点及信号通路等研究尚不充分，有学者提出从生物网络角度研究中药及复方化学成分调控机体复杂系统的作用机制[8-9]。因此，本文借助网络药理学技术，从中药成分-靶点-通路角度探讨徐长卿-紫草-地肤子治疗湿疹可能的作用机制，以供参考。

1 材料与方法

1.1徐长卿、紫草、地肤子活性成分的挖掘与筛选 中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)是一个包含中药成分信息及对应靶点信息的中草药系统药理平台[10]。它包括中药成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数，如口服生物利用度(OB)、药物相似性(DL)、血脑屏障透过率等。本研究应用TCMSP数据库，挖掘徐长卿、紫草、地肤子的所有成分，并得到各成分的关键参数，以OB≥30%，DL≥0.18作为筛选活性成分的依据。

1.2徐长卿、紫草、地肤子活性成分作用靶点的预测 利用TCMSP数据库获取徐长卿、紫草、地肤子中筛选出的每个活性成分对应的潜在靶点信息，然后利用UniProt(https://www.uniprot.org)数据库中的UniProtKB搜索功能对不同来源的靶点进行检索，限定研究物种为Homo sapiens，得到所有靶点的基因名，将用于后续网络药理学分析。

1.3湿疹靶点的挖掘 以“eczema”为关键词在以下4个数据库进行检索，获取湿疹靶点的有效信息：①DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca，最后更新：2020年7月2日)；②OMIM数据库(http://www.omim.org/，最后更新：2020年7月28日)；③GeneCards数据库(https://www.genecards.org，Version 5.0)；④TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/，最后更新：2020年6月1日)。

1.4核心靶点筛选 利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具绘制徐长卿、紫草、地肤子有效活性成分靶点和湿疹靶点的韦恩图，从而得到交集靶点。

1.5蛋白质相互作用关系分析 蛋白质功能的执行需要借助不同蛋白质之间的相互作用来实现，String (https://string-db.org/)数据库囊括了预测和已知的蛋白质相互作用的数据库[11]，故将筛选得到的徐长卿-紫草-地肤子治疗湿疹的交集靶点蛋白以基因名的形式上传到该数据库，研究物种设置为Homo sapiens，进行蛋白与蛋白相互作用分析，得到蛋白质相互作用网络图。

1.6KEGG信号通路富集分析 利用DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov)对交集靶点蛋白进行KEGG信号通路富集分析和GO通路富集分析。在DAVID下属Functional Annotation工具中的列表中粘贴目标基因，类型选择Gene List，Select Identifier选择official gene symbol，物种和背景均选择Homo sapiens，提交后获取KEGG数据及GO数据。通过后续从生物过程及信号通路程角度探讨徐长卿-紫草-地肤子治疗湿疹可能的作用机制，继而绘制KEGG通路富集气泡图和GO细胞组分、分子功能、生物过程三合一图。

2 结果

2.1徐长卿、紫草、地肤子活性成分 中药常以口服方式给药，故以OB、DL值筛选，共得到20个化合物，徐长卿、紫草、地肤子各包括6、12、2个活性成分，徐长卿包含cynatratoside B、cynapanoside C、tomentogenin等成分，紫草包含acetylshikonin、Isoarnebin 4、lithospermidin A等成分，地肤子包含11,14-eicosadienoic acid、Stigmasterol(表1)。

表1 徐长卿、紫草、地肤子活性成分

2.2湿疹活性成分的靶点预测及湿疹靶点挖掘 检索TCMSP数据库得到徐长卿、紫草、地肤子活性成分的靶点共49个。然后，通过主题词检索DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD四个在线数据库共得到1702个湿疹的相关靶点。将上述两个数据集取交集得到19个交集靶点(图1)，主要包括PGR、PTGS1、PTGS2、ESR1、AR、NR3C1等(表2)，用于后续网络药理学分析。

2.3活性成分-靶点相互作用网络构建与分析 利用Cytoscape3.7.1软件构建活性成分-靶点相互作用网络，得到了一个包含30个点和36条边的网络(图2)。图中蓝色部分XCQ、ZC、DFZ分别代表徐长卿、紫草、地肤子，绿色部分代表有效成分MOL ID，紫色部分代表靶点名称。依据Degree值由大到小排名，分别为13、5、4、4、3、3、2、2，对应的有效成分依次是豆甾醇(MOL000449)、毛红厚壳内酯A(MOL005619)、谷甾醇(MOL000359)、1-甲氧基乙酰紫草素(MOL007714)、[(1R)-1-(5,8-dihydroxy-1,4-dioxo-2-naphthyl)-4-methyl-pent-3-enyl](MOL007715)、亚油酸乙酯(MOL001494)、徐长卿苷C(MOL005625)、cynapanoside CEthyl oleate(MOL002883)。

图1 靶点基因筛选图

2.4蛋白质相互作用关系分析 将半徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹相关的19个交集靶点输入String数据库进行分析，去除没有连接的靶点蛋白，得到蛋白质相互作用关系网络图(图3)。结果显示，该网络图包含17个点，34个边，平均degree值为3.58，平均局部聚类系数0.663，P<0.01。图中各靶点之间不同颜色的线代表不同的证据，主要是绿色代表相邻基因，红色代表融合基因，蓝色代表共现基因，连接线越粗，蛋白之间相互作用越强。

2.5KEGG 信号通路和GO富集分析 使用DAVID数据库对徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹所涉及的交集靶点蛋白进行KEGG信号通路富集分析，最终确定10条通路，包括Phenylalanine metabolism、Arachidonic acid metabolism、Serotonergic synapse等(表3)。同时，利用KEGG富集得到的数据，绘制富集气泡图(图4)。

表2 徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹相关靶点

图2 徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹药效成分-靶点相互作用网络图

图3 徐长卿-紫草-地肤子与治疗湿疹药效靶点蛋白质相互作用网络图

表3 KEGG 通路富集

图4 KEGG 通路富集气泡图

GO富集分析：Biological process分析主要包括多巴胺分解代谢过程、对寒冷的反应、平滑肌收缩的正调控、褐色脂肪细胞分化、信号转导。Cellular component分析主要包括质膜。Molecular function分析主要包括类固醇激素受体活性、类固醇结合、酶结合、前列腺素-过氧化物合酶活性、ATP酶结合、药物结合、去甲肾上腺素结合、受体结合、锌离子结合、肾上腺素结合、伯胺氧化酶活性(图5)。

图5 GO分析：富集BP、CC、MF

3 讨论

湿疹是由多种内外因素，如食物、吸入物、内分泌及代谢改变等相互作用导致的一种具有明显渗出倾向的急慢性皮肤炎性反应[12]，其病理机制复杂，现代研究认为多与遗传易感性、免疫系统调节失调、皮肤微生物群改变有关[13]，常与支气管哮喘、过敏性鼻炎合并发生[14-16]。中医认为，湿疹多因禀赋不耐，脾虚湿恋，气血运行不畅，肤失所养而发病，临床多于辨治方中配伍徐长卿、紫草、地肤子等。徐长卿辛温，归肝、胃经，在《神农本草经》中被列为上品，多用于湿疮[17]，湿疹久发难愈，卫气已虚，瘙痒难忍，徐长卿不仅祛风，还能镇静和抗过敏止痒[18]；紫草甘寒，归心、肝经，属清热凉血药，能够清热凉血，活血解毒。文献研究[19]发现湿疹用药以此类药最多。《仁斋直指方》中紫草膏及现代紫草油[3,20]用于湿疹效佳，这可能与其抗菌抗炎作用相关[21]；地肤子苦寒，归肾、膀胱经，擅除皮肤中之风邪湿热，既往研究[22-23]均以本药为湿疹必用药，对顽固性湿疹亦可配伍此药[24]。为了系统探讨徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹的药效物质基础及潜在生物学机制，本研究借助网络药理学方法，通过筛选三种中药的活性成分，收集湿疹相关靶点，预测分析药靶关系及对应通路。

考虑到药物的相似性及吸收率，应用TCMSP平台设置OB≥30%，DL≥0.18的筛选标准，共挖掘到徐长卿、紫草、地肤子的有效成分分别为6、12、2个。并在DrugBank、OMIM、GeneCards和TTD数据库中检索到湿疹的有效靶点1 702个，两者交集获得19个共同靶点。这些治疗湿疹靶点对应的药效成分组属于徐长卿的有3个，紫草的5个，地肤子1个。而所得的治疗湿疹的靶点中，徐长卿的有6个，紫草的9个，地肤子12个。本研究发现，三味中药均存在一个药效成分对应两个或多个靶点的情况，地肤子的药效成分仅1个，但其对应的治疗湿疹的靶点却有12个，故应重视其治疗湿疹的作用。通过String平台数据库构建PPI网络发现，ADRB2、NR3C1、PGR、PTGS2等位于网络图的关键节点处，且这些蛋白之间存在着非单线单向作用的复杂联系，根据combined_score，排名前五的蛋白组合分别是ESR1-PGR、MAOB-MAOA、AR-NR3C1、ADRB1-ADRB2、ESR1-NR3C1，因此靶点之间的相互作用与调节可能是徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹的潜在机制之一。

借助DAVID数据库对徐长卿、紫草、地肤子靶点蛋白进行KEGG信号通路富集分析发现10条重要通路，但花生四烯酸代谢信号通路引起了笔者关注。花生四烯酸是一种人体必需的不饱和脂肪酸，当受到多种刺激时，可转变成具有生物活性的代谢产物，如白三烯、前列腺素、血栓素等[25]，这些代谢产物可参与湿疹的发病[26]。如白三烯既能以效应因子和趋化因子身份直接参与炎症反应，还能促进γ干扰素与白介素2等细胞因子的合成、释放，放大炎症反应[27]。前列腺素可能通过扩张血管及增加血管通透性造成湿疹患者疱疹、红斑及渗出等表现[28]。在此通路中，PTGS2、PTGS1、LTA4H通过影响前列腺素和白三烯的生成而调节花生四烯酸代谢过程；通过GO功能富集分析也发现，前列腺素-内过氧化物合酶活性通路参与了徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹的过程，进一步佐证了前列腺素在湿疹中的重要作用，以及通过下调其生成释放可能是治疗湿疹的一种方法。综上，可能表明徐长卿、紫草、地肤子通过调控这些酶的生成或释放以调节花生四烯酸代谢，减少炎症介质的产生，干预湿疹的发病过程，从而减轻湿疹症状或改善患者的主观感受，为病情的发展变化带来一定益处，但仍有待于进一步深入研究。

总之，湿疹是一种内外因素共同导致的疾病，现存治疗手段仍存不足，中药以其多成分、多靶点、多途径的特点在改善湿疹方面显示一定优势。本文基于网络药理学初探徐长卿、紫草、地肤子治疗湿疹可能的作用机制，具备一定的合理性，初步展示了中药治疗疾病的整体性和全面性，为相关实验研究做铺垫，也为研究中医药治疗疾病的药效机理提供新思路。