石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠行为学的影响及其机制研究*

郝野陆 牛文民

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院神经外科，甘肃 兰州 730000；2.陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西 咸阳 712000)

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指突发性、威胁性或灾难性事件导致个体延迟出现并长期持续的精神障碍[1-2]。PTSD发病后具有病程长、难以治愈、自杀率高等特点[3]。因此，创伤性事件暴露后及早干预以求有效逆转或终止PTSD发病就显得尤为重要。然而，目前可用于早期干预PTSD的有效药物却非常少[4]。中药因其纯天然、安全有效、副作用小等特点，在PTSD防治中具有广阔的应用前景[1]，中药挥发油经嗅觉通路在防治精神类疾病方面取得了较好的疗效[5-6]。石菖蒲(AcoriTatarinowii，AT)是一种常用的芳香开窍类中药，中医素有“芳香解郁”之说[5]，石菖蒲挥发油已经用于抑郁症、焦虑症及其他精神疾病的治疗[7-8]，但关于石菖蒲挥发油经嗅觉通路对PTSD进行早期干预尚未见报道。

下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴负反馈增强是PTSD有别于其他精神类疾病如抑郁症的一个重要特征[3-9]。研究表明，糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)基因与PTSD发病之间关系密切[10-11]。最近有学者认为，GR可能是PTSD防治的一个重要干预靶点[10]。海马是HPA轴的高位调节中枢之一，海马中的GR密度远高于其他脑区，在调节和维持HPA轴功能平衡中起着重要作用[3]。本文通过观察石菖蒲挥发油吸嗅早期干预经嗅觉通路对PTSD模型大鼠行为学的影响，探索其海马GR基因相关机制，一方面为PTSD的早期干预提供有效药物，另一方面为中医药防治PTSD提供新的研究思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重(210 ± 20)g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，许可证号：SCXR(甘)2015-0001，饲养于兰州大学基础医学院医学实验中心SPF级清洁鼠房，许可证号：SYXK(甘)2018-0002。

1.2药品与试剂 石菖蒲饮片(批号：180307211，康美药业股份有限公司)；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物科技研究所)；蛋白Marker(Protein Ladder，美国赛默飞世尔科技公司)；GR及β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗，武汉三鹰生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.3主要仪器设备 OFT-100开场活动实验箱及视频分析系统、PMT-100高架十字迷宫及视频分析系统(成都泰盟软件有限公司)；BCD-178TMPT 4℃、-20℃低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)；Forma 702 -80℃超低温冰箱(美国Thermo公司)；Infinite M200酶标仪(瑞士Tecan公司)；Mini-PROTEAN Tetra 165-8001蛋白电泳仪(美国Bio Rad公司)；Rephile Direct-Pure UP超纯水系统(上海乐枫生物科技有限公司)；Centrifuge 5424R小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；BSA124S-CW电子分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；C280化学发光成像系统(美国Azure公司)。

1.4大鼠双侧嗅神经切断(ONT)及PTSD造模方法 在PTSD造模前3 d，以7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用脑立体定位仪将其固定。切开位于大鼠颅顶正中的皮肤后，小范围分离暴露前囟。在大鼠颅顶正中线位于前囟前面5 mm两侧旁开2 mm处，分别钻两个直径为1 mm的小孔，以暴露并不损伤嗅球为宜。用显微解剖镊将嗅球前端的硬脑膜提起，锐性切断双侧嗅神经，在相应部位用明胶海绵压迫止血，伤口处点青、链霉素后对切开部位进行缝合。

采用目前公认的国际PTSD科学会议确定的单一延长应激(SPS)造模方法来建立PTSD大鼠模型，包含四个部分：束缚应激、强迫游泳、乙醚麻醉和孤养。首先，将大鼠水平禁锢于圆锥形束缚器中2 h(使大鼠四肢及躯干束缚在束缚器中，仅尾巴可活动)；随后立即强迫游泳20 min，水深40 cm，水温25 ℃；恢复15 min后用乙醚麻醉至意识丧失；随后单独饲养7 d。

1.5实验分组与给药 实验分组为：CON(对照)组，PTSD(模型)组，ONT+PTSD(嗅神经切断+模型)组，PTSD+AT(模型+石菖蒲吸嗅)组，ONT+PTSD+AT(嗅神经切断+模型+石菖蒲吸嗅)组，每组8只大鼠。将石菖蒲饮片粉碎过40目筛，经超临界CO2萃取(萃取压力22.5 MPa，萃取温度43 ℃，解析压力4.0 MPa，解析温度25 ℃，萃取时间126 min)，从萃取釜收集挥发油备用。将石菖蒲挥发油、蒸馏水以1∶49浓度配置，盛放于香薰灯内，置于密闭的实验盒底部，并加热，让药物充分挥发，弥漫整个实验盒内，后将大鼠放置在中间带多孔的薄铁栏栅上，将实验盒盖盖上。PTSD吸嗅组在孤养期间给予每天2次(上下午各一次)、每次1 h、共计7 d的石菖蒲挥发油吸嗅处理，PTSD非吸嗅组及CON组在洁净空气中自然饲养。

1.6行为学检测 行为学检测在PTSD组孤养结束的时间点进行，顺序如下：拒俘反应实验、开场实验、高架十字迷宫实验。

1.6.1拒俘反应实验 用手套轻抓大鼠，观察并记录其反应。具体记分标准如下：0分，很容易抓取；1分，尖叫或回避；2分，尖叫并回避；3分，逃脱；4分，逃脱并尖叫；5分，试图撕咬手套；6分，主动跃起攻击。根据评分来评价大鼠的易激惹程度，评分越高则说明易激惹程度越高。

1.6.2开场实验 开场实验装置是一个75×75 cm的矩形区域，四周环绕着防止动物逃走的壁。每一只大鼠被单独放在开场的中央，之后在开场中自由活动10 min，期间大鼠的活动被相应的软件录像并分析。在一只大鼠测试结束之后，用75%的酒精溶液将开场擦拭干净，之后进行下一只大鼠的测试。大鼠在开场实验中的中央活动路程百分比被作为反映焦虑水平的指标，百分比越高，则说明焦虑水平越低。

1.6.3高架十字迷宫实验 高架十字迷宫外形似“+”，离地50 cm，从中央平台(10 cm×10 cm)向四周延伸出2个相对的闭臂(45 cm×40 cm×10 cm)和2个相对的开臂(45 cm×10 cm)。每只大鼠被单独放在迷宫的中央，面对其中一个开臂，之后在迷宫中自由活动5 min。大鼠在迷宫中的活动被相应的软件录像并分析。大鼠在迷宫中的开臂进入次数百分比被作为反映焦虑水平的指标，百分比越高，则说明焦虑水平越低。

1.7Western blot法测定蛋白表达 在PTSD组孤养结束的时间点进行大鼠海马组织取材。7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后以颈椎脱臼法处死，并断颈取头，取出大鼠海马组织。常规方法检测大鼠海马组织中GR蛋白表达并定量。蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，行封闭、一抗、二抗杂交等步骤，化学发光显色，凝胶图像分析系统测定光密度值。计算检测的目的蛋白(GR)与内参蛋白(β-actin)条带的光密度比值来表示检测蛋白的表达水平。

1.8统计学方法 用SPSS25.0进行统计学分析，对于各组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，对于组间均数的两两比较采用最小显著差数(LSD)法，统计学意义上的显著性定义为P<0.05，用GraphPad Prism 9.0绘制图表。

2 结果

2.1石菖蒲挥发油吸嗅早期干预减轻了PTSD模型大鼠的易激惹程度 与对照组大鼠相比，PTSD模型组大鼠在拒俘反应实验中的评分明显升高(P<0.05)，表明其易激惹程度明显升高。经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，PTSD模型大鼠的易激惹程度有所减轻(P>0.05)。行双侧嗅神经切断的PTSD模型大鼠经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，与PTSD模型组大鼠相比，其易激惹程度未见明显变化。PTSD模型大鼠行双侧嗅神经切断后，其易激惹程度未见明显变化。详见图1。

图1 石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠在拒俘反应实验(RTC)中评分的影响

2.2石菖蒲挥发油吸嗅早期干预明显减轻了PTSD模型大鼠的焦虑水平 与对照组大鼠相比，PTSD模型组大鼠在开场实验中的中央活动路程百分比明显降低(P<0.01)，在高架十字迷宫实验中的开臂进入次数百分比明显降低(P<0.001)，表明其焦虑水平明显升高。经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，PTSD模型大鼠的焦虑水平明显减轻，表现为在开场实验中的中央活动路程百分比明显升高(P<0.05)，以及在高架十字迷宫实验中的开臂进入次数百分比明显升高(P<0.05)。行双侧嗅神经切断的PTSD模型大鼠经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，与PTSD模型组大鼠相比，其焦虑水平未见明显变化。PTSD模型大鼠行双侧嗅神经切断后，其焦虑水平未见明显变化。详见图2、图3。

2.3石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠海马GR蛋白表达水平的影响 与对照组大鼠相比，PTSD模型组大鼠海马GR蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，PTSD模型大鼠海马GR蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。行双侧嗅神经切断的PTSD模型大鼠经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，与PTSD模型组大鼠相比，其海马GR蛋白表达水平未见明显变化。PTSD模型大鼠行双侧嗅神经切断后，其海马GR蛋白表达水平未见明显变化。详见图4。

图2 石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠在开场实验中的中央活动路程百分比的影响

图3 石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠在高架十字迷宫实验中的开臂进入次数百分比的影响

图4 石菖蒲挥发油吸嗅早期干预对PTSD模型大鼠海马GR蛋白表达水平的影响

3 讨论

PTSD是指突发性、威胁性或灾难性事件导致个体延迟出现并长期持续的精神障碍[1- 2]，是目前世界范围内广泛关注的重要公共卫生问题之一[3]。PTSD发病后具有病程长、难以治愈、自杀率高等特点[3]，不仅给患者及其家庭带来严重影响，也给社会带来了沉重负担。因此，创伤性事件暴露后及早干预以求有效逆转或终止PTSD发病就显得尤为重要。现有PTSD的早期干预方法主要分为早期心理干预和早期药物干预两种[12]。但早期心理干预存在主观性强、缺乏外部评价体系、客观指标少、个体差异大等不足[12-13]。据PTSD研究现状而言，早期药物干预较之早期心理干预更为理想[12]。然而，目前可用于早期干预PTSD的有效药物却非常少[4]。因此，寻找能够及早干预PTSD的有效药物并深入探索其作用机制具有重大意义。

中药因其纯天然、安全有效、副作用小等特点，在PTSD防治中具有广阔的应用前景[1,14]。研究发现，镇惊温胆汤可改善PTSD模型大鼠的焦虑和恐惧状态[15]；加味逍遥散可通过刺激别孕烯醇酮的合成从而改善PTSD模型大鼠的行为异常[16]。嗅觉是人类最基本的感觉之一，嗅觉功能与抑郁症、焦虑症、PTSD、精神分裂症等多种精神疾病有关[17-19]。中药挥发油是存在于某些中药材中的一类具有挥发性的液体成分，具有独特的芳香气味和经鼻入脑的转运途径。中医素有“芳香解郁”之说[5]，中药挥发油经嗅觉通路防治精神类疾病具有易于透过血脑屏障、患者依从性好、副作用小等特点[5-6]。研究表明，苍艾挥发油雾化吸入在大鼠慢性不可预见应激致抑郁模型中发挥保护作用[20]；苏合香挥发油吸嗅在小鼠急性应激致抑郁模型中具有抗抑郁和抗焦虑的作用[21]。但中药挥发油经嗅觉通路发挥对PTSD的防治作用尚未见报道。

石菖蒲是天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根茎，其性温，味辛、苦，具有芳香之气，归心、胃二经，是一种临床上常用的芳香开窍类中药[22-24]。石菖蒲挥发油主要成分包括α-细辛醚和β-细辛醚，活性均较强，是其发挥药理作用的主要物质基础，有学者认为石菖蒲主要通过其挥发油发挥药理作用[6,8]。石菖蒲挥发油已经用于抑郁症、焦虑症及其他精神疾病的治疗[7,8,25]，但关于石菖蒲挥发油经嗅觉通路对PTSD进行早期干预尚未见报道。本研究发现，经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，PTSD模型大鼠在开场实验中的中央活动路程百分比明显升高(P<0.05)，在高架十字迷宫实验中的开臂进入次数百分比明显升高(P<0.05)，在拒俘反应实验中的评分亦有所降低(P>0.05)，表明石菖蒲挥发油吸嗅早期干预减轻了PTSD模型大鼠的易激惹程度及焦虑水平。行双侧嗅神经切断的PTSD模型大鼠经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，与PTSD模型组大鼠相比，其焦虑水平未见明显变化，说明石菖蒲挥发油有效作用的发挥有赖于嗅觉通路结构的完整性，提示石菖蒲挥发油吸嗅经嗅觉通路在早期干预PTSD中发挥有效作用。本研究所提出经嗅觉通路早期干预PTSD的新理念，以及发现石菖蒲挥发油吸嗅在早期干预PTSD中的有效作用，均尚属国内外首次，原创性强，是中医科研思路与中医防治精神疾病探索的深入与创新。

HPA轴负反馈增强是PTSD有别于其他精神类疾病如抑郁症的一个重要特征[3,9]。海马是HPA轴的高位调节中枢之一，海马中的GR密度远高于其他脑区，在调节和维持HPA轴功能平衡中起着重要作用[3]。研究表明，PTSD模型大鼠海马中GR表达增加，可能引起了HPA轴负反馈增强[9-11]。临床研究发现，PTSD患者海马、杏仁核和内侧前额叶皮层均出现GR表达异常的现象[26]。因此最近有学者认为，GR可能是PTSD防治的一个重要干预靶点[10]。本研究发现，与对照组相比，PTSD模型大鼠海马GR蛋白表达水平升高，这与之前的研究相一致[27-29]。经石菖蒲挥发油吸嗅早期干预，PTSD模型大鼠海马GR蛋白表达下调，这提示石菖蒲挥发油吸嗅早期干预PTSD的作用机制可能与海马GR基因有关。关于GR基因调控的机制，最近的研究发现，GR基因的甲基化修饰在其中发挥重要作用[30-32]。但本次实验未对大鼠海马GR基因的甲基化水平进行检测，为不足之处，将留待后续进一步研究。

综上，本研究发现石菖蒲挥发油吸嗅早期干预减轻了PTSD模型大鼠的易激惹程度及焦虑水平，其作用的发挥有赖于嗅觉通路结构的完整性，提示石菖蒲挥发油吸嗅经嗅觉通路在早期干预PTSD中发挥有效作用，其作用机制可能与海马GR基因有关。