三乌胶丸HPLC 指纹图谱及多指标成分定量分析研究

罗才琴，肖素芸，吕 冬，曲 媛,2,3，崔秀明,2,3**，段嫏环

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南省三七资源可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500；3.国家中药材产业技术体系昆明综合试验站，云南 昆明 650500)

三乌胶丸又称“云南黑药”曾与“云南白药”齐名，传统用于治疗风寒湿邪、中风偏瘫、类风湿性关节炎、风湿性肌炎、骨质增生等[1].目前，发现三乌胶丸治疗脑卒中后遗症有效率达95%以上[2].三乌胶丸由生草乌、生川乌、何首乌、附片、生白附子等 5 种药材组成，其中黄草乌、川乌、附片为剧毒[3-5]药材.三乌胶丸中乌头碱类二萜生物碱既是活性成分也是毒性成分，其中生黄草乌、生川乌等剧毒药材经过三乌胶丸的处方工艺蒸煮后，其双酯型毒性较大的生物碱如乌头碱[6]、滇乌碱等逐渐向单酯型毒性较小的生物碱转化.因此，本研究选取了转化后含量较高且有指标意义的乌头类二萜生物碱作为三乌胶丸的含量控制指标，并且同时测定了三乌胶丸中佐药何首乌的指标性成分大黄素.

中药指纹图谱技术可对中药进行质量评价，是国际公认的质控可行模式，是中成药疗效的保证[7].目前，相关文献对三乌胶丸的质量控制研究主要集中在单个药材或单个成分的含量测定[8-9]，未见三乌胶丸的指纹图谱及多指标成分测定的报道，不足以控制三乌胶丸的整体质量.此外，未见同时测定乌头类生物碱和蒽醌类成分的报道.基于此，本研究所开发的三乌胶丸HPLC 指纹图谱的方法，同时对15 个批次的三乌胶丸中包括乌头类生物碱和大黄素在内的6 个活性成分进行含量测定，为三乌胶丸的质量控制和评价提供理论及实验依据.

1 材料

1.1 仪器电子天平（AL-104 型，梅特勒−托利多仪器有限公司）；旋转蒸发仪（德国艾卡科技有限公司，IKA-RV3）；高效液相色谱仪（Agilent1260，安捷伦科技有限公司）；超声波清洗器（KQ-5200E 型，昆山市超声仪器有限公司）；优普系列超纯水器(UPTI-20T 型，成都超纯科技有限公司)

1.2 材料苯甲酰乌头原碱（wkq20041505）、苯甲酰次乌头原碱（wkq20041702）、苯甲酰新乌头原碱（wkq20041701）购自四川省维克奇生物科技有限公司.草乌甲素（Yz042122）、8−去乙酰滇乌碱（Yz0201221）、大黄素甲醚（Yz040122）、大黄素（Yz080920）来源于南京源植生物科技有限公司.磷酸、乙腈为色谱级，二乙胺、乙醚、石油醚（沸程在30～60 ℃）、氨水为分析纯，水为超纯水.

1.3 样品黄草乌Aconitum vilmorinianumKom.为毛茛科乌头属多年生草本植物的干燥块根（产地：云南，批号：200301）；川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的干燥母根（产地：陕西，批号：171201）；附片（黑顺片）为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品（产地：四川，批号：191002）；何首乌为为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根（产地：云南，批号：200601）；白附子为天南星科植物独角莲Typhonium giganteumEngl.的干燥块茎，此处所用为禹白附（产地：四川，批号：191101）；三乌胶丸（规格：5 g ×12 袋），批 号：190651、190906、190907、190908、200602、200603、200604、200901、200902、200903、200606、200607、200608、200611、200612，编号依次为S1～S15）均由云南金乌黑药制药有限公司提供.

2 方法与结果

2.1 色谱条件测定波长：245 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；色谱分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(ϕ4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.2%二乙胺（磷酸调节pH 为4.0）水溶液(A)−乙腈(B)，梯度洗脱（0～15 min，10%～20%B；45～55 min，40%～70%B，70～75 min，70%～100%B，85～100 min，100%B）.

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取苯甲酰新乌头原碱（BMA）、苯甲酰次乌头原碱（BHA）、苯甲酰乌头原碱（BA）、8−去乙酰滇乌碱（8-DYA）、草乌甲素（CCA）、大黄素（ED）的对照品适量，精密称定，用酸性甲醇（每100 mL 甲醇里面精确加入盐酸1 mL）配制成含大黄素2 mg/mL，8−去乙酰滇乌碱1.8 mg/mL，草乌甲素2.1 mg/mL，苯甲酰新乌头原碱2.8 mg/mL，苯甲酰次乌头原碱1.9 mg/mL，苯甲酰乌头原碱2.6 mg/mL 的混合对照品溶液，待用.

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取三乌胶丸粉末（过0.356 mm 筛，50 目）1.0 g，加入石油醚5 mL后低温超声(250 W，50 kHz)5 min 后，静置，40 ℃以下挥干石油醚.三乌胶丸残渣加入氨溶液3 mL，润湿；加入乙醚20 mL，称定质量，低温超声60 min后，用乙醚补足失量；再同法处理1 次.合并2 次乙醚液，32 ℃以下减压浓缩挥干，残渣加入酸性甲醇1 mL 溶解，过有机系0.45 μm 滤膜，备用.

2.2.3 单味药和阴性对照品溶液的制备 按三乌胶丸的处方工艺分别制备三乌胶丸的黄草乌、川乌、附片（黑顺片）、何首乌的单味药样品和缺黄草乌、缺川乌附子、缺何首乌的阴性对照品.按照“2.2.2”下的方法对单味药样品及三乌胶丸的阴性对照品进行提取，制成单味药样品溶液和阴性对照品溶液备用.

2.3 三乌胶丸HPLC 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验 按本文所述色谱条件连续进针6 次同一份三乌胶丸（批号：200903）的供试品溶液10 μL，记录HPLC 图.以5 号峰苯甲酰新乌头原碱（S）为对照峰，通过计算得到18 个三乌胶丸共有特征峰的相对保留时间RSD<0.42%，18 个三乌胶丸共有特征峰的相对峰面积的RSD<2.97%，表明本文方法精密度良好.

2.3.2 重复性试验 按照本文所述的方法取同一个批次的三乌胶丸各1.0 g（批号：200903）制作相同的6 份三乌胶丸供试品溶液，进样上述三乌胶丸样品溶液6 份10 μL 测定，记录HPLC 图.以5号峰苯甲酰新乌头原碱（S）为对照峰，通过计算得到18 个三乌胶丸共有特征峰的相对保留时间的RSD<0.45%，18 个三乌胶丸共有特征峰的相对峰面积的RSD<3.68%，方法重复性良好.

2.3.3 稳定性试验 按本文三乌胶丸的色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h 进样同一份三乌胶丸样品溶液（批号：200903）10 μL 检测，记录HPLC 图.以5 号峰苯甲酰新乌头原碱（S）为对照峰，通过计算得到18 个三乌胶丸共有特征峰的相对保留时间的RSD<1.09%，18 个三乌胶丸共有特征峰的相对峰面积的RSD<2.80%，实验结果表明，在24 h 内，三乌胶丸样品溶液稳定.

2.4 三乌胶丸指纹图谱的建立

2.4.1 指纹图谱建立及相似度评价 按本文的色谱条件制备三乌胶丸样品溶液，进样15 批次三乌胶丸的供试品溶液10 μL(S1～S15)，记录HPLC图.对15 个批次的三乌胶丸样品色谱数据采取中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行匹配，以S4号三乌胶丸样品色谱图为参照，采取全谱匹配一共标定18 个三乌胶丸共有特征色谱峰，生成如图1所示的三乌胶丸共有模式R.经软件分析计算15批样品相对于对照指纹图谱R 的相似度分别为0.944、0.978、0.952、0.936、0.967、0.951、0.947、0.935、0.988、0.958、0.980、0.962、0.987、0.978、0.952，均大于0.9，说明各样品之间具有良好的一致性，指纹图谱叠加图谱及共有模式见图1.

图1 15 批三乌胶丸 HPLC 指纹图谱和对照指纹图谱（R）Fig.1 HPLC fingerprints and reference fingerprint(R)of 15 batches of Sanwujiaowan

2.4.2 色谱峰的指认、归属 取混合对照品溶液、供试品溶液及单味药溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行依次进样，色谱如图2 所示.通过与混合对照品进行对比，指认出其中的6 个共有色谱峰，分别为：5 号峰苯甲酰乌头原碱，6 号峰苯甲酰新乌头原碱，7 号峰苯甲酰次乌头原碱，8 号峰8−去乙酰滇乌碱，11 号峰为草乌甲素，12 号峰大黄素；将各单味药材色谱图与三乌胶丸样品色谱图比对分析（图3）得：峰4、8、9、11、14 来自黄草乌，峰5、6、7、14 来自于川乌，峰12、13 来源于何首乌，峰16、17、18 来源于乳香，峰5、6、7、14 来源于黑顺片.

图2 混合对照品、三乌胶丸样品色谱图Fig.2 HPLC diagram of mixed reference substance and Sanwjiaowan sample

图3 三乌胶丸样品和单味药色谱图Fig.3 HPLC diagram of single herbs and Sanwujiaowan sample

2.5 三乌胶丸中6 种成分的含量测定

2.5.1 专属性分析 分别精密吸取混合对照品溶液、三乌胶丸阴性对照品溶液10 μL，按“2.1”项下的色谱条件分析，记录色谱图，结果见图4.由图4可知，阴性样品色谱在与对照品相应保留时间位置上无色谱峰，表明对测定无干扰，方法专属性良好.

图4 混合对照品、三乌胶丸样品及阴性样品的HPLC 图Fig.4 HPLC diagram of mixed reference substance,Sanwujiaowan sample and negative sample

2.5.2 线性关系的考察 精密吸取用酸性甲醇稀释至2 倍、4 倍、20 倍、100 倍、200 倍的混合标准品溶液10 μL，按本研究三乌胶丸指纹图谱的色谱条件检测草乌甲素等6 个待测化合物的峰面积.以混合标准品质量浓度（X）为横坐标，6 个待测化合物的峰面积（Y）为纵坐标，计算各个化合物的标准回归方程，求得6 个待测化合物的回归方程及线性范围.以信噪比S/N的3 倍作为检出限，S/N的10 倍作为定量限，如表1 所示.

表1 6 个成分的线性回归方程、相关系数及线性范围Tab.1 The regression equation，correlation coefficients and linear ranges of 6 components

2.5.3 精密度试验 按本文的色谱条件6 次不间断进样10 μL 上述制得的混合标准品溶液，检测保留时间及峰面积.计算得到6 个待测化合物的峰面积的RSD<2.95%，保留时间的RSD<0.08%，表明本文方法精密度良好.

2.5.4 重复性试验 精密称取同一个批次的三乌胶丸1.0 g（批号：200903），按照本文所述的方法制作相同的6 份三乌胶丸供试品溶液，取上述6 份三乌胶丸样品溶液连续进样10 μL，记录三乌胶丸中6 个待测化合物的保留时间和峰面积.计算得到6 个待测化合物的峰面积的RSD<3.05%，保留时间的RSD<0.24%，表明本文所述的方法的重复性良好.

2.5.5 稳定性试验 按本研究的三乌胶丸的液相条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h 依次进样10 μL 上述制得的三乌胶丸样品溶液（批号：200903），测得保留时间，测定峰面积.6 个化合物的峰面积RSD 分别为大黄素1.01%，苯甲酰次乌头原碱1.23%，8−去乙酰滇乌碱2.22%，苯甲酰乌头原碱1.79%，草乌甲素0.57%，苯甲酰新乌头原碱2.37%，实验结果表明，在24 h 内，三乌胶丸样品溶液稳定.

2.5.6 加样回收率 精密称定6 份已知含量的三乌胶丸（批号：200903），每份1.0 g，分别置具塞锥型瓶中，每份依次精确加入含量相当的大黄素、苯甲酰乌头原碱、8−去乙酰滇乌碱、苯甲酰次乌头原碱、草乌甲素、苯甲酰新乌头原碱的标准品溶液.按本文所述得色谱条件制备样品溶液，依次进样依次进样10 μL 三乌胶丸样品溶液，计算6 个待测成分的平均加样回收率，结果草乌甲素、苯甲酰乌头原碱、8−去乙酰滇乌碱、苯甲酰次乌头原碱、大黄素、苯甲酰新乌头原碱平均加样回收率依次为100.3%，98.7%，100.2%，99.2%，98.4%，100.2%，RSD 依次为2.35%，1.97%，1.60%，2.06%，1.66%，1.19%.

2.5.7 QAMS 质量评价模式相对校正因子的测定 取上述2.2.1 项下6 个待测成分的不同质量浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件记录各成分的峰面积，以苯甲酰新乌头原碱（BMA）为内参物，采用斜率法和多点校正法计算6 个待测成分间的相对校正因子（RCF）.两种方法的结果见表2，相对误差（RE）<3.0 %，表明上述2 种计算相对校正因子的方法无明显差异，本研究采取斜率法用于三乌胶丸一测多评法的含量.

表2 6 个待测成分的相对校正因子Tab.2 The relative correction factors（RCF）of 6 components to be tested

2.5.8 6 个待测成分色谱峰的定位参数测定及重复性考察 通过公式 RTRi/s=tRi/tRs，计算5 个待测成分与内参物苯甲酰新乌头原碱（BMA）间的相对保留值（RTRi/s），其中tRi为待测成分保留时间，tRs为内参物保留时间，结果见表3.

表3 6 个待测成分的相对保留时间值（n =6）Tab.3 Relative retention values of six components to be tested（n =6）

2.5.9 一测多评法与外标法测定结果比较（表4）取15 批三乌胶丸样品，再按本研究的色谱条件依次进样10 μL 三乌胶丸供试品溶液，将6 个待测化合物的峰面积代入表2 的标准曲线计算6 个化合物的含量（外标法）.采取斜率法计算的相对校正因子，计算QAMS 中三乌胶丸中6 个待测成分的质量分数.

表4 ESM 与QAMS 测定三乌胶丸中待测成分的质量比（μg·g−1，n =3）Tab.4 Contents of Sanwujiaowan by external standard method(ESM)and quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)method(μg·g−1,n =3)

2.6 化学计量分析方法参考文献[10-12].

2.6.1 CA 聚类分析 以15 批三乌胶丸样品的6 个待测化合物的质量分数为变量，运用SPSS 23.0软件进行CA 聚类分析，如图5 所示.当聚类距离为15 时，15 批三乌胶丸样品可分为2 类，其中S1～S4 号样品被聚为一类，S5～S15 号样品被聚为一类，表明各批次的三乌胶丸具有一定的差异性.经过对比批号与查阅生产日期发现，聚类分析结果表明，三乌胶丸呈现按照生产年限进行分类，推测可能是原料药的产地及加工过程中有一定的差异性所造成的.

图5 15 批三乌胶丸样品聚类分析图Fig.5 Clustering analysis of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

2.6.2 PCA 主成分分析 将15 批三乌胶丸样品的6 个待测化合物的质量分数运用SPSS 23.0 软件标准化处理后进行PCA 主成分分析，三乌胶丸HPLC 指纹图谱PCA 的特征值、方差贡献率详见表5.取三乌胶丸中特征值大于0.99 的前2 个主成分，其累计贡献率达71.535%>70%，可作为三乌胶丸的评价指标.将得到的成分矩阵进行最大方差法旋转，得到6 个指标在2 个主成分中的旋转矩阵，见表6.以6 个待测化合物质量分数标准化处理后为变量，进行向量运算，计算PCA 得分.取上述向量运算结果，绘制主成分得分图，见图6.结果显示，15 批的三乌胶丸的样品被分为2 类，其中S1～S4号样品聚为第一类，S5～S15 号样品被聚为第二类，与聚类分析结果完全一致.

图6 15 批三乌胶丸样品主成分分析得分图Fig.6 Loading plot of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

表5 主成分分析特征值及方差贡献率Tab.5 The principal component value and contribution rate

表6 三乌胶丸样品主成分因子旋转载荷矩阵Tab.6 Factor load matrix after rotation transform of Sanwujiaowan

2.6.3 OPLS-DA 偏最小二乘判别分析 以15 批三乌胶丸6 个待测化合物的质量分数为变量导入SIMCA 14.0 软件，进行OPLS-DA 建模分析，获得相应的模型，见图7.15 批三乌胶丸样品被分为2 类，与主成分分析和聚类结果一致.采用变量重要性投影（VIP）法筛选导致样品分类差异较大的标志性成分，以VIP>1.0 为标准，筛选出对三乌胶丸样品分类贡献较大的3 个成分，依次为5 号色谱峰（苯甲酰新乌头原碱）、8 号色谱峰（8−去乙酰滇乌碱）、11 号色谱峰（草乌甲素），以上3 种物质来自于黄草乌、川乌及黑顺片中，导致了不同批次三乌胶丸含量及成分上的差异.

图7 15 批三乌胶丸样品的偏最小二乘判别分析得分图Fig.7 PLS-DA score scatter plot of 15 batches of Sanwu jiaowan

3 讨论

3.1 色谱条件优化本文在研究前期对流动相体系进行了考察，考察了乙腈−四氢呋喃（体积比25∶15）（B）−0.1 mol/L 乙酸铵溶液（每1 000 mL 加冰醋酸0.5 mL）（A），乙腈（B）−0.1%的磷酸水溶液（A），甲醇（B）−0.1%的磷酸溶液（A），乙腈（B）−0.1%二乙胺溶液（磷酸调节pH=4.0）（A），乙腈（B）−0.2%二乙胺（磷酸调节pH=4.0）（A），乙腈（B）−0.1%三乙胺（磷酸调节pH=3.0）（A），对比各色谱峰的峰型、基线的平稳、分离度及拖尾等情况，最终选择乙腈−0.2%二乙胺（磷酸调节pH=4.0）体系.

三乌胶丸中主要活性成分是乌头类的生物碱，其中黄草乌的主要成分是滇乌碱、草乌甲素等[13-14]，其最佳检测波长是260 nm，而川乌的主要活性成分为乌头碱等二萜生物碱，其检测波长是235 nm[15-17]，何首乌中大黄素类的检测波长为254 nm[18].故本研究对检测波长进行了优化，发现其在245 nm 处各峰的分离度很好，峰型最佳，故选择波长245 nm 为本文的检测波长.

本研究对流动相梯度进行了优化，在试验了各个梯度后，最终选择“2.1”项下的梯度，其峰型较佳，各个峰之间的分离良好，基线较为平稳.

3.2 提取溶剂和提取时间的考察本文前期考察了甲醇、乙醇、异丙醇−乙酸乙酯、乙醚提取对试验结果的影响，最终选择了乙醚提取法[19].对提取时间也进行了考察，考察了20、30、40、60 min 时对提取效率的影响.选择提取时间为60 min，提取方式为低温超声提取.

3.3 测定成分的选择三乌胶丸的方剂组方遵循了“君、臣、佐、使”的配伍原则，生草乌、生川乌为君药，附子（黑顺片）为臣药，何首乌为佐药，冰糖、猪蹄为使药.生黄草乌、生川乌分别主要含有滇乌碱、乌头碱等双酯型乌头碱，经过三乌胶丸的处方工艺进行蒸煮后，主要转换成8−去乙酰滇乌碱、苯甲酰乌头原碱等单酯型毒性较小的二萜生物碱.本研究根据三乌胶丸的处方组成及各味药材的主要功效，考察了君药黄草乌的指标性成分：8−去乙酰滇乌碱、草乌甲素；川乌的指标性成分：苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱[20]；佐药何首乌的指标性成分：大黄素的含量.

3.4 三乌胶丸含量测定结果分析本文建立了三乌胶丸的指纹图谱，对15 个批次的三乌胶丸的指纹图谱进行相似度评价，结果表明其相似度均在0.9 以上，一共确定了18 个共有峰.以15 批次三乌胶丸的6 个待测成分的含量进行CA、PCA 和OPLS-DA 化学计量分析，均将15 批次的三乌胶丸分为2 类，3 种分析方法结果保持一致.OPLS-DA分析结果表明（图7）苯甲酰新乌头原碱、8−去乙酰滇乌碱、草乌甲素含量是导致不同批次三乌胶丸差异的主要成分.以上分析结果均表明S1～S4 号样品被聚为第一类，生产于2019 年，S5～S15 号样品被聚为第二类，生产于2020 年.表明引起三乌胶丸质量差异的原因可能与原药材的产地、三乌胶丸成品存放的时间与方式、生产月份的温度、空气湿度、天气情况等都息息相关.本文所建立的方法能较为准确、科学、全面地反映三乌胶丸中的化学成分，不仅为三乌胶丸的质量研究提供参考，还可为含有乌头碱类相似成分如小活络丸、木瓜丸、芪苈强心胶囊等质量研究提供参考.