氧化苦参碱对皮肤创面愈合中PCNA、α-SMA及Type Ⅰ collagen的影响

刘俊梅,刘彦红，李 娟，戴贵东，郑 萍

氧化苦参碱(OMT)是宁夏苦豆子中单体化合物，是一种具有四环喹嗪啶类结构的生物碱，分子式为C15H24N2O2。相关文献表明，氧化苦参碱具有多种药理作用，如抗血管、抗心律失常、抗肿瘤、杀菌、抗炎等[1-4]。创面愈合过程中，多种炎症因子及细胞修复共同参与其中，而氧化苦参碱对其是否具有作用，目前国内外未见相关报道。本实验旨在以小鼠背部全层皮肤缺损为实验模型，应用氧化苦参碱进行干预，探讨其对小鼠皮肤创面愈合的影响及可能机制，为临床创面愈合提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：清洁级♂昆明种小鼠，体重(22±2)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(宁)2009-0003。

1.2 药品与试剂：氧化苦参碱购自宁夏紫荆花药业股份有限公司，纯度：99.8%，批号：P0100226；戊巴比妥钠和多聚甲醛购自Sigma公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)检测试剂盒和血清增殖细胞核抗原(PCNA)检测试剂盒购自ImmunoWay公司；细胞Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)检测试剂盒购自abcam公司；实验用水为超纯水。

1.3 主要仪器:PMZ000型病理图像分析系统(德国LEICA公司)；MIAS2000病理图像分析软件(川大智胜软件公司)；Rm2015型切片机(德国LEICA公司)；数码相机(日本尼康公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠皮肤创面制备及实验动物分组：1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，背部去毛，暴露皮肤，用2%碘酒和75%酒精依次消毒后，背部正中剪除全层皮肤，制备1.5 cm×1.5 cm正方形伤口，创面自然干燥，止血。制备创面后，24只♂小鼠随机分为4组：创面对照组，氧化苦参碱低、中、高剂量组(20、40、80 mg/kg)，除创面对照组给予等体积生理盐水外，其余各组分别按20、40和80 mg/kg给予氧化苦参碱灌胃，每天1次，共14 d。实验第3、5、7、9、11、14 d，每组分别取6只小鼠称重，戊巴比妥钠过量麻醉处死。

1.4.2 小鼠皮肤创面观察：①观察指标：每天观察并记录小鼠毛色、摄食、饮水及活动情况，包括创面色泽、质地、有无渗液、是否感染、水肿、肉芽组织生长情况等。在1、3、5、7、9、11、14 d时麻醉小鼠，描绘未愈合皮肤创面。②描绘创面面积:将描绘的创面区域均匀涂黑，采用清华紫光A900扫描仪及美国Image-Pro PlusVersion6.0(IPP)图像分析软件分析并计算各组小鼠未愈合创面面积，与原创面面积比较，评价创面愈合情况。③小鼠皮肤创面组织的Van Gieson染色：实验第 3、5、7、9、11和14 d 时，从创面组织正中线处剪开，取左侧一半创面组织及周边正常皮肤，10%多聚甲醛内固定24 h后，用流水冲洗3 h，然后梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片。酸性复红和苦味酸以1∶9比例混合，配成VG染色液染色30 s，用分化液分化4 s后脱水，透明，用中性树胶封片。载玻片置于400倍光学显微镜下,观察小鼠皮肤创面处胶原纤维生长情况并采图。

1.5 小鼠皮肤创面组织中PCNA、α-SMA和Type Ⅰ collagen的免疫组织化学方法检测：石蜡切片脱蜡、梯度乙醇脱水后，对组织进行高压热抗原修复，室温冷却，PBS冲洗3次，2 min/次(检测α-SMA的切片不修复)。3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，置于室温孵育20 min，甩去液体，PBS冲洗3次，2 min/次，滴加一抗，室温孵育1.5～2 h(PCNA Polyclonal Antibody (YT3617)1∶400、α-SMA Polyclonal Antibody(YT5053)1∶1000、Anti-CollagenⅠantibody (ab34710)1∶800。PBS冲洗3次，2 min/次；除去PBS溶液后滴加二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3次，2 min/次；除去PBS溶液后，将新配置的DAB显色工作液滴于载玻片上，显微镜下观察2～8 min；自来水终止反应；切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗。

2 结果

2.1 氧化苦参碱对小鼠皮肤创面愈合的外观观察：小鼠皮肤创面随时间逐渐被新生肉芽组织填充，上皮覆盖，部分毛发生成。第1 d，各组小鼠皮肤创面边缘收缩，创面无感染。第3、5 d，创面对照组创面较干燥，分泌物较少，创面有肉芽组织充填，肉芽较粗大；氧化苦参碱各组创口周围毛发明显生长，创面较为湿润，肉芽组织色泽红润、肉芽略显细小，生长良好。第7、9 d，各组创面已形成瘢痕，触之较硬，结痂易碎。第11 d，各组小鼠皮肤创面微小，已无结痂覆盖。第14 d，各组小鼠皮肤创面基本愈合。

2.2 氧化苦参碱对小鼠皮肤创面未愈合面积的影响：描绘小鼠皮肤未愈合创面面积结果显示，各组小鼠皮肤创面描绘面积随时间推移不断缩小，直至创面愈合。与创面对照组相比，氧化苦参碱20 mg/kg组在第5 d，氧化苦参碱40 mg/kg组在第7、11 d 时小鼠未愈合面积显著减小(P<0.05)；其余各时间点，氧化苦参碱组与创面对照组小鼠创面未愈合面积差异无统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 氧化苦参碱对小鼠皮肤创面未愈合面积的影响

2.3 氧化苦参碱对小鼠皮肤创面组织VG染色的影响:伤后第11 d，创面对照组的创面几乎被肉芽组织充填，皮肤创面中纤维细胞呈细长梭状，排列紊乱，胶原纤维增生不明显；氧化苦参碱各给药组创面几乎完全被肉芽组织充填，且成纤维细胞减少，纤维细胞明显增多，肉芽组织新生胶原纤维排列整齐。镜下可观察到阳性细胞在近创缘组织、创面基底部、新生的肉芽组织和表皮细胞中逐渐增加表达，但维持水平及时间各实验组存在差异。氧化苦参碱20 mg/kg组创面中α-SMA第3 d 最低，之后开始上升，在愈合中、后期表达量大幅度增加，到第9、11 d 时达最高峰。氧化苦参碱40、80 mg/kg组中α-SMA的表达呈现较平稳趋势。氧化苦参碱40 mg/kg组Type Ⅰ collagen表达在第3 d 时最低(P<0.05)，到第5 d 时达高峰，之后下降再上升，呈波浪形表达。氧化苦参碱80 mg/kg组Type Ⅰ collagen第3 d 最低(P<0.05)，之后开始迅速上升，到第7 d 时表达显著性升高(P<0.05)，之后逐渐下降，见表2。

表2 小鼠皮肤创面组织中PCNA、α-SMA、Type Ⅰ collagen含量组织学评分结果(分，

3 讨论

在皮肤创面形成早期，机体免疫系统被激活，较多中性粒细胞浸润，随后出现单核细胞、巨噬细胞浸润[5]。入侵微生物被炎症细胞吞噬，并通过炎症细胞释放各种细胞因子和生长因子促进创面的修复。研究结果显示，氧化苦参碱使小鼠创面愈合过程的中、后期未愈合创面面积显著减小；Van Gieson染色结果显示，氧化苦参碱组创面被新生表皮覆盖，新生纤维胶原与表皮平行生长，呈现有序排列，较创面对照组肉芽组织填充更快，新生毛细血管增多，促进创面早期修复[6-7]，以给药第9 d及第11 d效果最为明显。提示氧化苦参碱可促进小鼠皮肤创面愈合。

PCNA是评价细胞增殖状态的重要指标[8-9]。静止的细胞PCNA几乎不表达。皮肤组织中的PCNA主要定位于表皮基底层细胞、毛囊上皮细胞、血管内皮细胞及部分成纤维细胞的细胞核内，在皮肤组织的发生与修复过程中PCNA表达增强[10]。研究表明，通过YAG 激光及强脉冲光激光多次刺激小鼠皮肤，增强了PCNA 表达，使皮肤细胞增殖活性增强，促进皮肤结构重建，达到促进创面愈合的效果[11]。本实验研究结果显示，在愈合过程中，氧化苦参碱(20、40、80 mg/kg)组在7 d 时PCNA 表达高于创面对照组，对小鼠创面组织细胞的增殖具有促进作用。提示在小鼠创面愈合过程中、后期，氧化苦参碱使PCNA表达显著增加。

α-SMA是一种异常的纤维细胞-肌纤维母细胞，与创面收缩关系密切[12-13]。目前认为，α-SMA 的表达使肌成纤维细胞的收缩能力增加，使肉芽组织纤维化，促进结缔组织的形成[14]。本实验研究发现，α-SMA 在创面形成初期3 d 时开始表达。氧化苦参碱(20 mg/kg)组的α-SMA随时间表达量逐渐增加，到创面愈合中、后期α-SMA表达量较高，而未愈合创面面积明显减小。提示氧化苦参碱促进小鼠皮肤创面愈合与α-SMA表达有关。

成纤维细胞是创面愈合过程中的主要细胞，成纤维细胞合成的胶原是细胞外基质的主要成分，其中包括Type Ⅰ collagen，细胞依附其生长。当成纤维细胞生长受到抑制，细胞形态会发生明显改变，Type Ⅰ collagen分泌减少，从而影响创面愈合[15]。本实验研究发现，创面对照组的VG染色显示新生纤维胶原的增加主要见于真皮全层，可见分布均匀、排列稀疏、呈波浪样、红色深染胶原纤维束，而氧化苦参碱各组小鼠损伤部位皮肤胶原纤维染色略深，成熟胶原增加，但以浅层变化较为明显。免疫组织化学结果显示，小鼠皮肤创伤后，Ⅰ型胶原纤维在创伤愈合早、中期排列较为紊乱；愈合后期第7、9 d时Ⅰ型胶原纤维排列较为规律；组织学评分结果显示，氧化苦参碱各给药组Ⅰ型胶原纤维的表达在愈合过程各时间点的整体水平高于创面对照组，各组呈现由低到峰值再下降的趋势。提示氧化苦参碱可增加小鼠皮肤创面中Ⅰ型胶原纤维的表达。

综上所述，氧化苦参碱能增加皮肤创面的愈合中PCNA、α-SMA及Type Ⅰ collagen的表达。由于创面愈合过程复杂，影响因素众多，氧化苦参碱对创面愈合的影响是否通过其他作用靶点，还需要进一步研究。