贵州不同品种花椒麻味物质的测试分析

程玉波，魏浩华，曾钦朦，罗红，王港*

1. 晴隆县林业局（黔西南州 561400）；2. 江西马头山国家级自然保护区管理局（抚州 335300）；3. 贵州省林业科学研究院（贵阳 550000）

花椒属芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）的植物花椒（Zanthoxylum bungeanum）或青椒（Zanthoxylum schinifolium）的干燥成熟果皮[1]，其对气候的适应性强、耐干旱、根系发达，因此它具有良好的生态价值，花椒主要分布在亚洲、美洲、非洲等热带及亚热带地区[2]。中国不仅是花椒原产国，而且还是主产国之一，在2 000多年前我国就有把花椒作为防腐剂和香物[4]的记录。据中国植物志记载，中国有约45种花椒，13种变种，主要分布在长江以南及西南的地区[5]。贵州省是花椒的重要产区之一，成为当地村民的经济来源。近年来，花椒被列为贵州省农村产业革命12个农业特色产业，并在德江和贞丰等县已经形成规模化的发展，且贵州贞丰县有着“中国花椒之乡”的美誉[6]。花椒是“药食同源”植物，具有巨大的药用价值，在治疗麻疹病[7]、疟疾[8]和糖尿病[9]等疾病中效果较好，并且还可用于解热、镇痛、抑菌等[10-11]。

现有研究报道中，花椒主要的化学成分有酰胺类物质[12]、挥发油[13]、黄铜类化合物[14]、生物碱[15]、萜类[16]、多酚[17]、维生素E及人体必需的8种氨基酸等成分[18]。酰胺类物质主要存在于花椒的果皮中，主要成分包括羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素或酰胺化合物的异构体[19-20]，它是花椒麻味的主要来源，可作为花椒内部质量的指标，研究者已从中分离出30多种酰胺类物质[21-22]，其部分化学结构式见图1。研究发现α-山椒素与γ-山椒素会产生灼烧感，β-山椒素产生麻木感，羟基-α-山椒素产生刺痛感等[23]。酰胺类物质的质量分数和种类与花椒的产地、品种等因素有关[24]。

近年来，大部分对花椒麻味物质的研究主要集中在甘肃、四川、陕西、重庆等全国闻名的种植基地所产的花椒，而贵州花椒虽然种植面积不断扩大，本土花椒也受广大人民的喜爱，但对其的研究报道较少，缺乏支撑数据，导致贵州花椒的市场竞争力较弱，品牌效应较差。试验采用HPLC法对贵州不同品种花椒麻味物质质量分数进行测定，分析贵州不同品种花椒的品质，并进行对比分析，旨为贵州花椒的品质鉴定提供科学数据，也为贵州花椒产业的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贵州贞丰顶坛花椒、云南昭通青花椒、重庆江津九叶青花椒（见表1）。经自然晾干后去籽，备用。

羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素对照品（纯度≥98.00%，成都曼思特生物科技公司）；去离子水（美国MILLIPORE公司）；甲醇、乙腈（成都杰锐科技有限公司）；超声清洁器（KH-50B，昆山超声仪器有限公司）；高速万能粉碎机（FW-100，北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物提取

采用超声波提取方法可提高提取率，能够在花椒中提取更多的有效成分[25]。将花椒样品用高速万能粉碎机（FW-100）进行粉碎，且过0.250 mm（60目）筛，混合均匀进行称量（约5 g）；每个样品倒入250 mL带塞子的锥形烧瓶中加入50 mL甲醇；使用超声清洁器（KH-50B），将锥形烧瓶放入其中，在30 ℃下进行超声处理30 min；冷却至室温加入甲醇并充分振摇，进行过滤（0.22 μm膜）。

称取羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素对照品，将其溶解于甲醇中至质量浓度为2 mg/mL；先过滤（0.22 μm膜），再将溶液注入高效液相色谱（HPLC）中。

1.2.2 HPLC色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以乙腈-去离子水为流动相梯度洗脱（A：乙腈，B：去离子水）。梯度程序：35% A，0 min；35%～40% A，5～10 min；45%～65% A，25～50 min；90%～35% A，55～60 min。洗脱流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，检测波长268 nm，进样量2 μL，时间60 min。

1.2.3 质量分数测定

取不同品种的羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素对照品溶液，采用HPLC检测外标法，按照1.2.2中色谱条件进样，并测定出响应值（3个峰面积的总和），每个样品平行测定3次，根据标准曲线得出回归方程，并计算出各花椒麻味物质的质量分数。

2 结果与分析

2.1 HPLC色谱分析

通过HPLC法检测花椒麻味物质的溶液，得到色谱图（图2）。图2A是羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素对照品溶液的色谱图，分别在38.030，26.360及27.566 min出峰，分离度在1.21～ 11.67 min；图2B是不同花椒品种麻味物质溶液的色谱图，不同花椒品种色谱峰的分离度与色谱柱分离度高，均达到基线分离。说明采用HPLC法对花椒麻味物质分离效果好，峰无分叉，也无拖尾，结果可靠。

图2 HPLC色谱图

2.2 标准曲线的建立与分析

精密吸取100 μg/mL的花椒麻味物质对照品溶液，用甲醇进行稀释至质量浓度分别为0.01，0.05，0.10，0.20和1.00 μg/mL，按照1.2.2的色谱条件依次进样，测定羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素对照品溶液的响应值，即3个峰的面积总和，每个样品平行测3次，以其质量浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标作图，绘制标准曲线（图3），进行线性回归，得到回归方程（表2）。不难发现，各回归方程的相关系数（R2）均大于0.995，说明不同花椒品种的麻味物质线性关系良好。

表2 回归方程

图3 标准曲线

2.3 精密度

吸取对照品溶液（10 μL），按1.2.2的色谱条件，连续进样，共6次，测定羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素的峰面积，并计算其RSD，分别为1.13%，1.17%及1.06%，说明HPLC色谱系统的精密度良好。

2.4 重复性

称取花椒样品6份（每份称取0.5 g），根据1.2.1的方法进行制备，进样10 μL，按照1.2.2的色谱条件测定各麻味物质的峰面积，记录数据，计算羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素的峰面积的SRSD分别为1.06%，1.24%和1.26%。说明HPLC法的重复性良好。

2.5 稳定性

称取花椒粉末1 g（精确0.001 g），根据1.2.1的方法提取花椒麻味物质，制备标准品溶液，吸取溶液（10 μL），按照1.2.2的色谱条件分别于0，2，4，8，16和24 h进样，评估其稳定性，并记录峰面积，计算出羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素峰面积的SRSD分别为1.35%，1.28%和1.46%，说明对照品溶液在24 h内的稳定性较好。

2.6 加标回收率

精密称取花椒粉末6份（每份0.25 g），分别加入适量对照品溶液，根据1.2.1的方法制备样品，计算出不同花椒品种羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素的平均加标回收率范围在97.96%～平共处101.58%，SRSD值分别为1.77%，1.41%和1.59%，说明HPLC法的准确性较好。

2.7 花椒麻味物质质量分数

不同花椒品种麻味物质的质量分数见图4。结果表明，不同花椒品种麻味物质总质量分数从大到小依次为顶坛花椒-贞丰＞顶坛花椒-德江＞九叶青花椒-德江＞青花椒-德江，分别为52.566，49.771，47.612和47.021 mg/g。羟基-α-山椒素质量分数最高，顶坛花椒-贞丰的质量分数最高，达到45.377±2.069 mg/g，羟基-β-山椒素质量分数的范围在3.875～7.733 mg/g，羟基-γ-山椒素质量分数的范围在3.236～3.432 mg/g，羟基-α-山椒素是羟基-β-山椒素的5～10倍，羟基-γ-山椒素的10倍以上，说明羟基-α-山椒素是花椒麻味物质中的主要成分，顶坛花椒中的质量分数高于其他品种花椒。

图4 花椒麻味物质质量分数

3 结论与讨论

采用HPLC法对贵州不同品种花椒麻味物质（羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素）进行检测。结果表明，花椒麻味物质的线性关系良好，R2≥0.995，分离效果较好，精密度、重复性、稳定性以及加标回收率的SRSD＜1.8，符合方法学考察的要求。从云南昭通、重庆江津及贵州贞丰引种在贵州德江进行种植，结果表明，云南昭通青花椒羟基-α-山椒素质量分数为38.262±1.214 mg/g，高于熊汝琴等[26]研究的昭通产青花椒的麻味物质质量分数（12.429 mg/g）；重庆江津的九叶青花椒羟基-α-山椒素质量分数为36.447±1.944 mg/g，高于原产地九叶青花椒的羟基-α-山椒素质量分数（13.365 mg/g）的2倍以上[27]；引种到贵州德江不同花椒品种的麻味物质质量分数均高于原产地，说明贵州德江的生态环境适合种植云南青和九叶青花椒。

杨清山等[28]研究的四川金阳青花椒麻味物质总质量分数（羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素）在25.54～32.30 mg/g；李般程等[29]研究的青花椒中，四川金阳青花椒麻味物质质量分数在29～31 mg/g，云南昭通青花椒麻味物质质量分数在26～31 mg/g，重庆江津青花椒麻味物质质量分数在24～27 mg/g。贵州本地顶坛花椒也是青花椒的一种，其3种麻味物质的质量分数均高于云南青和九叶青花椒，贵州贞丰的顶坛花椒麻味物质总质量分数最高，达52.566 mg/g，贵州德江的顶坛花椒麻味物质总质量分数为49.771 mg/g，均高于杨青山与李般程的研究结果，说明贵州本地的顶坛花椒麻味物质质量分数高于一些知名的青花椒，为贵州本地特色产业的开发利用提供科学依据，也为贵州顶坛花椒的品质评价提供理论基础。