不同剂量25羟基维生素D3对断奶前犊牛生长性能、营养物质表观消化率、血浆代谢物及粪便菌群的影响

2022-02-20王丽华徐宏建张全宇张城瑞冯冠智张永根

动物营养学报 2022年1期

王丽华徐宏建张全宇张城瑞冯冠智张永根

(东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030)

随着现代畜牧业的规模化发展，犊牛光照时间缩短，自身合成维生素D的含量减少，同时母畜长期采食未经阳光照射或日照过长的饲草，植物中的麦角固醇无法转变为维生素D2供机体利用，以及规模化的牧场使母畜光照时间缩短，无法通过紫外线照射将皮肤的7-脱氢胆固醇转变为维生素D3，使机体内没有足量的维生素D供乳汁合成，导致乳汁中维生素D的含量不足[1]。光照减少及乳汁中维生素D不足极易导致犊牛缺乏维生素D，钙磷失衡，进而引起软骨病、佝偻病及骨变形等疾病[2]，且断奶前犊牛处于快速生长发育阶段，对维生素D的要求更高，牛奶中的维生素D很难满足犊牛最佳生长和骨骼钙化需求，因此犊牛需要进行外源维生素D的补充。25羟基维生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25(OH)VD3]作为新型添加剂，直接在肾脏中羟化成活性形式1,25-二羟基维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2VD3]被机体利用[3-4]。饲喂25(OH)VD3不仅缩短了维生素D在肝脏中的一步羟化[5]，且拥有较长的半衰期，能较稳定的存在于机体内[6]。与维生素D3相比，25(OH)VD3在钙磷吸收、骨骼发育和免疫等方面拥有更高的生物效价[6]。已有报道称新生犊牛迅速实现维生素D充足需补充6 000～10 000 IU/kg维生素D3，同时代乳品中补充300 mg/kg 25(OH)VD3和1.2 mg/kg维生素D3可以改善犊牛生长性能及健康状况[7-8]。25(OH)VD3拥有比维生素D3更高的吸收效率和代谢活性[9]，饲粮中添加25(OH)VD3可以降低断奶仔猪炎症因子水平，减少腹泻，提高流行性腹泻抗病力[10-11]；同时可以避免肠道损伤以及肝脏、肾脏功能障碍[12]。25(OH)VD3可以促进骨骼发育，促进钙磷吸收，具有抗炎、抗氧化等功能，能更好地反映机体健康状况。

到目前为止，有关25(OH)VD3的研究虽然很多，但是对断奶前犊牛的研究鲜有报道，尚不清楚添加25(OH)VD3是否会对断奶前犊牛产生影响。因此，本试验旨在研究添加不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛生长性能、营养物质表观消化率、血浆代谢物及粪便菌群的影响，初步探讨新型添加剂应用于断奶前犊牛的可行性，以期为其合理应用于犊牛生产中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计、动物与饲养

所有动物试验操作均按照东北农业大学动物保护委员会的原则和操作指南进行(编号：NEAU-[2011]-9)。本试验在哈尔滨松花江奶牛场进行，试验选取18头体重相近、健康状况良好的荷斯坦新生犊牛，体重(40.68±1.21) kg，试验期56 d。犊牛出生后2 h内饲喂4 L初乳，12 h内再饲喂2 L初乳。将犊牛随机分为3组，每组6头。对照组不添加25(OH)VD3，低剂量组每头犊牛每天添加6 000 IU 25(OH)VD3，高剂量组每头犊牛每天添加12 000 IU 25(OH)VD3。25(OH)VD3由山东某生物工程有限公司提供，25(OH)VD3含量20 000 IU/g。饲喂时添加到牛奶中并用奶桶饲喂。牛奶(干物质含量13.55%，乳脂含量4.80%，乳蛋白含量3.44%)在饲喂前巴氏杀菌器杀菌。犊牛从开始到第56天，每天07:00、12:00和18:00饲喂3次，共6 L。开食料在1周之后开始提供，所有犊牛在整个试验期均在1.4 m×2.0 m的单栏中饲喂，可自由饮水和采食，且至少有10%的开食料剩余。开食料组成及营养水平见表1。

表1 开食料组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (DM basis) %

1.2 生长性能测定

记录每天开食料采食量。第28和56天对犊牛进行称重及体尺(体高、胸围和腹围)测量，计算平均日增重。每天观察犊牛健康状况，喂奶前观察犊牛粪便状态，对粪便进行评分(0=正常；1=半成型、糊状的；2=稀薄、但停留在垫草上；3=稀薄如水、渗透垫料)。当粪便评分≥2时提供治疗，直到腹泻停止。每天测定直肠温度判定发烧与否，大于39.5 ℃被判定为发烧。

1.3 饲料、粪便样品采集与测定

对饲料样品进行每周取样，最终混合成饲料样品分析其营养成分，于试验期第26、27、28、54、55和56天，通过直肠采粪法，连续3 d每隔6 h采集1次粪样，并将粪便缩合成2份，其中一份以每100 g添加5 mL 10%的稀硫酸进行固氮，另一份不作处理，将2份粪样冷冻保存直至分析营养物质表观消化率。饲料和粪样55 ℃烘48 h，回潮24 h，粉碎过40目筛。按AOAC(2000)[13]方法进行样品干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量分析。根据Van Soest等[14]方法用耐热α-淀粉酶测定中性洗涤纤维含量。参照AOAC(2000)[13]，采用电感耦合等离子质谱法测定样品的钙和磷含量。参照GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》方法，以盐酸不溶灰分(AIA)为内标测定营养物质表观消化率。其中饲料中营养物质含量包括开食料和牛奶中营养物质含量。于试验期第56天通过直肠采粪法采集粪便分装在冻存管，-80 ℃保存。

1.4 血液样品采集与分析

在试验第1、28和56天晨饲后3 h于犊牛颈静脉采血，并用负压肝素钠管收集血液，1 960×g离心15 min，将分离的血浆分装于1.5 mL清洁的离心管中，-20 ℃保存，待测。血浆葡萄糖、总蛋白、胆固醇含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性由北京华英生物技术研究所协助检测，试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司，测定仪器型号为迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。采用原子吸收法测定血浆钙和镁含量，采用钼蓝比色法测定血浆磷含量；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血浆白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量(北京华英生物技术研究所)，测定仪器型号为华卫德朗DR-200BS(无锡华卫德朗仪器有限公司)。血浆25(OH)VD3含量使用将来生物有限公司牛25(OH)VD3ELISA试剂盒进行测定。

1.5 粪便细菌群落组成分析

将保存的粪样送到北京百迈客生物科技有限公司，利用高通量测序技术测定细菌群落组成。提取粪便中的总DNA，提取的DNA进行3次高效高保真的PCR扩增，利用引物扩增16S rRNA基因的V3～V4区域，引物序列为338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，使用酶标仪和荧光试剂对扩增产物进行定量，按物质的量比例混合后在Illumina Hiseq测序平台进行测序。

1.6 数据处理和分析

生长性能、健康状况、营养物质表观消化率、血浆指标采用SAS 9.4的PROC MIXED模型进行分析，牛作为随机效应，处理、时间、处理×时间作为固定效应，初始的生长性能和血浆指标作为协变量加入模型。粪便菌群指标采用SAS 9.4的GLM模型进行分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。P≤0.05为差异显著，0.05

2 结果

2.1 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛生长性能及健康状况的影响

由表2可知，与对照组相比，低剂量组和高剂量组体重和平均日增重显著提高(P<0.05)，而低剂量组和高剂量组之间无显著差异(P>0.05)。与对照组和低剂量组相比，高剂量组体高显著提高(P<0.05)，而低剂量组和对照组之间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，低剂量组和高剂量组粪便评分显著降低(P<0.05)，而低剂量组和高剂量组之间无显著差异(P>0.05)。各组之间开食料采食量、胸围、腹围和直肠温度在均无显著差异(P>0.05)。

表2 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛生长性能及健康状况的影响Table 2 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on growth performance and health status of pre-weaning calves

2.2 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛营养物质表观消化率的影响

由表3可知，与对照组相比，低剂量组和高剂量组干物质表观消化率显著提高(P<0.05)，且低剂量组和高剂量之间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，高剂量组中性洗涤纤维(P=0.05)和钙表观消化率(P<0.05)显著提高，而低剂量组差异不显著(P>0.05)。各组之间粗蛋白质、粗脂肪、酸性洗涤纤维和磷表观消化率差异不显著(P>0.05)。

表3 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛营养物质表观消化率的影响Table 3 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on nutrient apparent digestibility of pre-weaning calves %

2.3 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛血浆25(OH)VD3、钙、磷、镁含量的影响

由表4可知，与对照组相比，低剂量组和高剂量组血浆25(OH)VD3含量显著提高(P<0.05)，且高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)。与对照组相比，低剂量组和高剂量组血浆钙含量显著提高(P<0.05)，且低剂量组和高剂量之间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，高剂量组血浆磷含量显著提高(P<0.05)，而低剂量组差异不显著(P>0.05)。各组之间血浆镁含量差异不显著(P>0.05)。

表4 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛血浆25(OH)VD3、钙、磷、镁含量的影响Table 4 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on contents of 25(OH)VD3, calcium, phosphorus and magnesium in plasma of pre-weaning calves

2.4 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛血浆生化指标和细胞因子含量的影响

由表5可知，与对照组相比，低剂量组和高剂量组血浆碱性磷酸酶活性存在降低趋势(P=0.06)，低剂量组和高剂量组血浆白细胞介素-2含量显著降低(P<0.05)。

表5 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛血浆生化指标和细胞因子含量的影响Table 5 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on plasma biochemical indexes and cytokine contents of pre-weaning calves

2.5 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛粪便菌群的影响

由表6可知，在犊牛粪便菌群科水平，与对照组相比，低剂量组和高剂量组粪便中毛螺菌科和普雷沃式菌科相对丰度显著提高(P<0.05)，低剂量组和高剂量组粪便中鼠杆菌科、克里斯滕森菌科、螺旋体科和未培养_细菌_o_柔膜菌纲_RF39(uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39)相对丰度显著降低(P<0.05)。

表6 不同剂量25(OH)VD3对断奶前犊牛粪便菌群相对丰度的影响Table 6 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on fecal microflora relative abundances of pre-weaning calves

3 讨论

尽管25(OH)VD3对断奶前犊牛的研究鲜有报道，但已有研究表明饲粮添加25(OH)VD3可以提高断奶犊牛平均日增重[8]。Fritts等[15]研究表明，母猪饲粮添加维生素D3或25(OH)VD3可以提高断奶仔猪的平均日增重。本试验结果与上述结果相似。本试验中，饲粮添加25(OH)VD3可以提高犊牛平均日增重和体重，且高剂量组体高显著高于对照组和低剂量组。原因与上述相似，即犊牛饲喂25(OH)VD3可以增加体内25(OH)VD3转化为活性1,25(OH)2VD3，促进钙转运蛋白产生[16]，增加血液中钙的吸收，进而促进骨骼发育，有助于犊牛平均日增重和体重的增加。研究表明，饲粮添加25(OH)VD3可以降低软骨发育不良及严重程度[5,17]，然而，Celi等[18]研究表明，25(OH)VD3对生长牛的体尺指标无显著影响。这与本研究结果不同，造成这种差异的原因可能是由于添加剂量与饲喂时期的不同，新生犊牛正处于快速生长阶段，对营养物质的吸收能力较强。此外，腹泻是所有幼小动物极易发生的肠道疾病，影响动物健康状态。Nonnecke等[19]研究结果显示感染病毒性腹泻的牛血清中25(OH)VD3含量降低了51%。而Yang等[10]的研究结果表明，饲粮添加25(OH)VD3可以降低仔猪流行性腹泻病毒感染。这与本试验结果一致，本研究结果显示饲粮添加25(OH)VD3降低了犊牛粪便评分，减少腹泻。

营养物质表观消化率直接反映动物对饲料中营养物质的利用。Duffy等[20]研究表明，饲粮添加25(OH)VD3可以提高育肥猪饲料中钙表观消化率。Adhikari等[21]研究表明，额外补充无论何种形式的维生素D都可以提高蛋鸡钙表观总消化道消化率。这与本试验所得结果一致，饲粮添加25(OH)VD3提高了钙表观消化率，此外本试验还得出饲粮添加25(OH)VD3提高了中性洗涤纤维和干物质表观消化率，原因可能是由于犊牛腹泻发生降低，健康状况得到改善，使瘤胃发育较好，瘤胃微生物及肠道微生物对营养物质的消化吸收增强。

血浆25(OH)VD3含量是衡量机体维生素D状态的重要指标。目前由NRC(2001)标准推荐的维生素D3要求的最低水平为300 IU/d，这是预防犊牛佝偻病所必需的最低水平[22]。在允许的范围内提高饲粮维生素D的含量有助于机体对钙磷吸收，维持健康和正常的生理功能。有研究表明，当血浆25(OH)VD3含量达到200 ng/mL时，有毒性作用[23-24]。在允许范围内添加25(OH)VD3时，1,25(OH)2VD3的产量增加，从而调节钙磷动态平衡的能力。有研究结果表明，饲粮添加25(OH)VD3可以提高泌乳牛血浆钙、磷和25(OH)VD3含量[25]。大量添加25(OH)VD3能提高血浆25(OH)VD3含量[26-27]。Duffy等[20]的研究结果显示，饲粮添加25(OH)VD3显著提高了犊牛血浆25(OH)VD3含量。本试验所得结果与上述研究结果一致，即饲粮添加25(OH)VD3可有效提高断奶前犊牛血浆钙、磷和25(OH)VD3含量。这是由于25(OH)VD3的添加使进入血液中25(OH)VD3含量增加，同时使肾脏中进一步羟化成活性形式的1,25(OH)2VD3含量增加，进而促进上皮细胞对钙、磷的吸收，从而使血浆中钙、磷含量增加。这也是骨骼发育加快，从而增加平均日增重和体重的原因。

碱性磷酸酶广泛存在于肝脏、骨骼、肾脏等组织中，随着犊牛快速生长伴随的骨质破坏和再生，会使大量的碱性磷酸酶释放进入血液。有研究表明，1,25(OH)2VD3可以提高骨源性细胞中碱性磷酸酶活性[28]，这与本试验所得结果一致。可能原因是饲粮添加25(OH)VD3后1,25(OH)2VD3活性形式增加，进而促进碱性磷酸酶活性增加。碱性磷酸酶活性的强弱可反映动物的生长速度和生长性能，提高血液中碱性磷酸酶的活性，有利于提高动物的平均日增重，参与细胞中的物质代谢，使犊牛的非特异性免疫功能增强。黄伟等[29]研究表明，血清25(OH)VD3含量与白细胞介素-2含量呈负相关，急性腹泻患儿补充维生素D可以抑制炎症细胞因子。本研究结果也发现饲粮添加25(OH)VD3可以降低血浆白细胞介素-2含量，与Müller等[30]的研究结果一致。可能是由于产生的1,25(OH)2VD3特异性受体介导，使血浆白细胞介素-2的含量降低。

瘤胃球菌科、毛螺菌科、理研菌科以及普雷沃式菌科作为有益菌，因其严格厌氧在犊牛肠道中占主导地位[31-32]。克里斯滕森菌科与uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39作为厚壁菌门细菌，虽然显著降低，但是相对丰度占比小。鼠杆菌科和螺旋体科均作为有害菌存在于犊牛的肠道中，极易使犊牛致病、腹泻，甚至死亡。鼠杆菌科作为导致腹泻的有害菌在对照组中相对丰度达12.75%，较高的相对丰度使对照组犊牛腹泻状况较添加25(OH)VD3组严重，粪便评分相对较高。饲粮添加25(OH)VD3后致病菌的相对丰度均有所降低，这说明饲粮添加25(OH)VD3可以提高犊牛健康状况，降低腹泻，这也印证了饲粮添加25(OH)VD3后犊牛粪便评分降低。