抗生素对腹泻仔猪肠道微生物及四环素耐药基因的影响

2022-02-20张雨琛徐婷婷钱梦琪杨智仁韩新燕

中国畜牧杂志 2022年2期

马馨，张雨琛，徐婷婷，钱梦琪，杨智仁,2，韩新燕,2*

（1.浙江大学动物科学学院，农业农村部华东动物营养与饲料重点实验室，浙江杭州 310058；2.海南浙江大学研究院，海南三亚 572000）

在养猪业中，仔猪由于肠道功能发育不完整而腹泻是一种常见现象，为预防腹泻，大量的抗生素被应用于饲料添加剂之中。在饲料全面禁抗背景下，仔猪腹泻风险增加，因此在生产中会采用抗生素注射来治疗仔猪腹泻。然而，随着抗生素的泛用、滥用，动物源性细菌耐药性形势严峻，不论是人兽共用抗生素还是动物专用抗生素的耐药性增高，均影响着食品安全与公共卫生安全，对医疗资源产生威胁。四环素类抗生素是一种广谱抗生素，菌群对四环素产生耐药基因的现象愈发严重，在猪场中可以普遍地检测到抗四环素基因的存在。因此，本研究旨在探讨用抗生素治疗腹泻会对仔猪肠道菌群结构、四环素类抗性基因含量的影响以及二者之间的相关性，为进一步探究菌群四环素耐药基因的产生原因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计试验动物为“杜×长×大”三元杂交哺乳仔猪。在同一栋猪舍同期出生的仔猪中，于10日龄左右随机选取体重3.2 kg左右且连续腹泻2 d以上的腹泻仔猪，采集其粪便样本作为腹泻组。按猪场常规治疗手段对腹泻仔猪用庆大霉素连续治疗3 d，采集治疗后仍腹泻仔猪的粪便样本作为抗生素治疗组。腹泻组与抗生素治疗组各随机选取6个样本进行检测分析。动物和试验设计经浙江大学动物保护和使用委员会批准。试验期间仔猪自由采食母乳和饮水，并按照猪场的正常免疫措施和管理模式进行饲养。

1.2 肠道菌群16S rDNA测序利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。16S rDNA扩增选择区域为V3-V4区，使用的通用引物为341F和806R。在通用引物的5′端加上适合Illumina Miseq PE250测序的index序列和接头序列，完成特异性引物的设计。Forward Primer（5′-3′）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）；Reverse Primer（5′-3′）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。以稀释后的基因组DNA为模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性和高效性。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物。回收后，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。文库质检合格后，使用Qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。使用Illumina Miseq PE250进行上机测序。

1.3 耐药基因的检测按照粪便基因组DNA提取试剂盒(TIA Namp Stool DNA kit)说明书提取样本DNA。首先通过PCR和电泳对8种四环素类抗性基因（）进行定性检测。对于定性检测到的基因进行定量测定。引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物序列如表1所示。反应体系为20 μL：SYBR Green Master Mix（2×Conc.）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，混合染料（50× Conc.）0.4 μL，模板（50 μg/mL）2.0 μL，ddHO 6.8 μL。定量PCR的程序条件：95℃预变性30 s，然后进行40个循环，循环内程序为95℃ 10s，退火30 s（退火温度见表2），熔解曲线95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15s。为消除PCR抑制物的干扰，DNA样品稀释10倍后再进行定量PCR。DNA的定量在LightCycler480II（Roche，德国）上进行。定量PCR扩增效率控制在100%±10%。同时检测熔解曲线是否出现非特异性扩增。

表1 ARGs和16SrDNA基因引物信息

1.4 统计分析数据均用SPSS 25.0统计软件处理，以平均数±方差表示，以<0.05为差异显著。各组间数据采用Duncan′s多重比较进行差异显著性检验。对微生物组数据进行Student′s检验，使用Pearson相关性分析生成肠道差异物种与耐药基因之间的相关矩阵，并利用Graphpad prism作图。

2 结果

2.1 抗生素对腹泻仔猪粪便菌群的影响

2.1.1 OUT分析腹泻组与抗生素组共有OTU数为142，腹泻组特有的OTU为377，抗生素治疗组特有的OTU为75（图1-A）。主成分分析初步反映出不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，结果表明腹泻组与抗生素组差异明显（图1-B）。物种累积曲线在急剧上升后变为上升舒缓，表明抽样充分（图1-C）。

图1 抗生素治疗后仔猪粪便菌群OTU分析

2.1.2 菌群α多样性分析如图2所示，抗生素治疗组菌群的Simpson、Shannon、Chao1指数以及物种数均显著低于腹泻组，说明抗生素治疗显著降低了腹泻仔猪肠道的菌群多样性。

图2 组间Alpha多样性盒型图

2.1.3 菌群结构分析物种分类和丰度分析结果显示（图3），腹泻仔猪的肠道菌群在门水平上共涉及到13个菌门，其中数量最大的菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes），次丰富的为厚壁菌门（Firmicutes）；此外还发现梭杆菌门（Fusobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）本身不存在于腹泻仔猪肠道中，而在使用抗生素后出现。在属水平上，普氏菌属（）是腹泻仔猪中最丰富的的菌属（54.7%），而抗生素组中最丰富的菌属为占比35.5%的拟杆菌属（）；另有梭菌属（）仅出现在抗生素组仔猪菌群中。

图3 不同分类水平组间菌群结构柱状图

2.1.4 菌群显著性差异分析在属水平上，检测出两组间丰度差异显著的17个菌属（图4），在抗生素组丰度显著提高的有拟杆菌属（）、志贺氏菌属（）、萨特氏菌属（）、副拟杆菌属（）、柯林斯氏菌属（）、；显著降低的有普氏菌属（）、拟普雷沃菌属（）、考拉杆菌属（）、粪球菌属（）、。

图4 属水平差异物种分析盒型图

2.2 抗生素腹泻仔猪粪便菌群耐四环素基因的影响对两组样品中8种常见的抗四环素基因进行定性检测后发现4种耐药基因的存在，对4种基因进一步进行定量检测，结果如图5-A所示，抗生素治疗组中含量均高于腹泻组，其中具有极显著差异。

2.3 抗生素处理组菌群与耐药基因相关分析如图5-B所示，对差异菌群及耐药基因进行相关性分析后发现，拟普雷沃菌属（）与4种抗四环素基因均存在负相关关系（<-0.6），梭菌属（）与3种基因存在正相关关系（>0.6）。另外，与基因正相关的菌属有拟杆菌属（）、；与tetC基因负相关的菌属有普氏菌属（）、考拉杆菌属（）、；与正相关的菌属有拟杆菌属（）、；与负相关的菌属有普氏菌属（）、考拉杆菌属（）、；与tetQ负相关的菌属有考拉杆菌属（）、。

图5 抗生素治疗猪粪便菌群与抗生素耐药基因相关分析

3 讨论

菌群作为生物体不可或缺的一部分，在仔猪的生长发育过程中起着重要作用。He等研究表明，在仔猪肠道中厚壁菌门和拟杆菌门是绝对优势菌门，这与本试验的结果一致。用抗生素进行治疗后，腹泻仔猪肠道菌群α多样性显著降低，说明抗生素会损害腹泻仔猪肠道菌群结构，导致其生物多样性下降。根据的丰度增加与减轻肠道屏障损伤改善代谢综合征有关的结论，推测本试验中，抗生素处理后其丰度增加与抗生素所发挥的抗炎作用有关。有研究指出，在低饲料利用率猪的肠道微生物群中拟杆菌属（）丰度较高，在自闭症儿童肠道中发现萨特菌（）引起消化障碍，本研究中抗生素治疗组中此2种菌属的丰度降低可能是由于抗生素的使用对仔猪消化系统产生了负面影响；同时，抗生素处理降低了厌氧菌和数量，此现象与攻毒后的猪菌群变化情况相似；考拉杆菌属（）、乳杆菌属、都是产酸菌，研究表明它们可以协助宿主进行脂肪酸代谢，本试验中抗生素治疗组考拉杆菌属数量显著降低，说明抗生素对某些有益菌属定植有着一定的消极作用。Langdon等研究发现菌群重建降低抗生素耐药细菌在艰难梭菌感染复发患者肠道中的定植，说明利用菌群与抗性基因间的相关关系可以防控耐药细菌感染和耐药性传播。徐成刚等对华南地区猪场中9种四环素耐药基因调查后发现，广泛分布于副猪嗜血杆菌中，而本研究发现的多种菌属与抗四环素基因间相关关系中并无存在，而是检测到4种基因；抗生素处理后菌群与耐药基因之间具有强的相关性，尤其是拟普雷沃菌属（）与4种抗四环素基因均负相关，推测该菌属少有携带抗四环素基因；而梭菌属（）与3种基因正相关，推测该菌属较多具有四环素耐药基因，与本试验结果类似。Tunsagool等研究发现工业化养殖条件下的猪盲肠中梭菌属和tetW基因正相关；徐先林等在儿童粪便中检测四环素耐药基因，总检出率为83.2%，说明了四环素耐药基因广泛分布，本研究证明抗生素治疗后的腹泻仔猪基因丰度显著升高，并且与多种菌属具有相关性，为从菌群调控角度降低细菌耐药性提供了新思路。